酵母杂交技术原理及应用资料.pptVIP

原理 噬菌体展示技术是将外源DNA 通过基因工程技术克隆到适当的噬菌体载体上，使外源DNA 片段对应的表达产物融合在噬菌体的衣壳蛋白上形成融合蛋白，呈现在噬菌体表面，被展示的多肽或蛋白可保持相对的空间结构和生物活性。然后利用靶分子，采用适当的淘洗方法洗去非特异结合的噬菌体，最终从噬菌体文库中筛选出能结合靶分子的目的噬菌体；外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面,而其编码基因作为噬菌体基因组中的一部分可通过噬菌体DNA 序列测序出来。 该技术的显著特点是建立了基因型和表现型之间的对应关系。 类型 1 　丝状噬菌体展示系统 丝状噬菌体属于单链环状DNA 病毒，编码10种蛋白质，其中与噬菌体展示有关的是p Ⅲ和p Ⅷ衣壳蛋白。p Ⅲ蛋白位于噬菌体颗粒的一端，有3 个～5 个拷贝，可在N 端、近N 端或N 端与C 端的柔性连接区融合外源肽或蛋白质。p Ⅲ蛋白对展示的外源多肽或蛋白质的大小无严格限制，但由于p Ⅲ蛋白的拷贝数只有3 个～5 个，在免疫学和生物疫苗研制中受到了限制。p Ⅷ蛋白位于噬菌体颗粒的两侧，一般在N 端或近N 端融合外源序列。由于p Ⅷ分子较小，只能融合较小的外源肽段，携带肽段太大会影响外壳的组装，使其失去感染力。但它的拷贝数多，因此该系统一般用于筛选亲和力较低的配体，高拷贝p Ⅷ蛋白在疫苗开发上具有潜在的应用价值。 2 　λ噬菌体展示系统 λ噬菌体是最早使用的克隆载体，其两端为不闭合的线形双链DNA，末端为长12 个核苷酸的互补单链。 λ噬菌体展示系统是将外源序列插入噬菌体头部组装必需的D 蛋白的N 端或C 端，或主要尾部蛋白PV 的羧基端折叠区(非功能区) ，实现外源蛋白的表面展示。 　　　λ噬菌体是在宿主细胞内完成装配的，无需将外源肽或蛋白分泌到细菌胞膜外，可展示有活性的大分子蛋白(100 ku 以上蛋白) 及对宿主细胞有毒性的蛋白，适用范围极广。 3 　T4 噬菌体展示系统 　　　T4 噬菌体展示系统是将外源肽/ 蛋白质与T4噬菌体的小外衣壳蛋白C 端融合而被展示，展示方法是利用一个选择性载体(或称之为整合载体)，将融合有外源序列的小外衣壳蛋白( small outer capsid　protein ,SOC) 融合基因同源整合入缺失SOC 的T4 基因组中，选择恢复溶菌酶生长不依赖性的噬菌体，即可将外源肽/ 蛋白质展示于噬菌体表面。SOC具有与噬菌体颗粒表面专一结合的能力，因此还可用体外组装的方法实现展示。方法是将SOC 及其融合衍生物在大肠埃希菌中表达，然后分离该融合蛋白，纯化后，加入到缺失SOC 的噬菌体颗粒或多聚头部，结合后即可达到展示目的。T4 噬菌体载体可以体外组装且系统容量大(35 ku 以上) ，拷贝数高，但由于其采用的是C 端融合，这对研究蛋白质N端的功能不适合，而使它在蛋白质生物研究中的应用受到局限。 　4 T7 噬菌体展示系统 T7 噬菌体衣壳蛋白通常有两种形式，即10A (344 个氨基酸) 和10B (397 个氨基酸) ，独特的10B衣壳蛋白区存在于噬菌体表面，所以被用作噬菌体展示。展示在T7 噬菌体表面的多肽或蛋白质不需要通过细胞膜分泌出来，因而其表面展示多肽和蛋白的范围较广。T7 噬菌体展示系统可以在其表面以高、中、低拷贝表达各种蛋白。极高拷贝数载体适合用于低亲合力的结合域，中拷贝展示载体适合用于分析中等亲和力的结合域，低拷贝数载体适合用于分析高亲和力结合域。T7 噬菌体展示系统是通过C 端融合表达蛋白，插入片段被克隆到T7 噬菌体载体基因10 的C 端。因此，即使插入片段内含有终止密码子，同样也可以被其表达和展示。 关于实验 溶液1 ：由葡萄糖，EDTA 和Tris.CL组成。葡萄糖的作用是增加溶液的黏度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏质粒DNA，EDTA 的作用是络合Mg2+等二价金属离子。防止DNA酶对质粒的降解，Tris能是溶菌液维持溶菌作用的最适ph范围。 溶液2：由SDS和NaoH组成。SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性，NaoH的作用是破坏氢键，使DNA变性 溶液3：由KAc与HAc组成，是ph为5.5的高盐溶液。能中和溶液2的碱性，使染色体DNA复性而发生缠绕并使质粒DNA复性。K+离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质。很容易与小分子的质粒DNA分离。此外，高盐溶液也有利于各种沉淀的形成。 人有