PCR原理及检测方法资料讲解.pptVIP

PCR检测对标本采集及保存、运输的要求 咽拭子、粪便、疱疹液、脑脊液等。 用于病毒分离和核酸检测的标本尽早采集。 病毒储存液保存。 冷链运输，尽快送至实验室进行检测。 -20℃长期保存，但是流感样病例标本应于-70℃长期保存 新型甲型H1N1流感检测 核酸提取 使用试剂： 核酸提取试剂盒QIAGEN RNeasy mini kit（74104）； 预冷的70%乙醇溶液（无RNase水配制）（自备）； β-巯基乙醇（自备） 基本步骤： 裂解组织，释放核酸； 除去蛋白杂质； 最后获得核酸产物 注意事项： 1提取核酸过程中使用的所有溶液和耗材必须 经过特殊处理，确保无RNase 2操作过程中必须尽量保持低温，迅速 3操作要在生物安全柜中进行，检测标本 样品和试剂必须在生物安全柜中才可以打开 操作中必须做好防护，防止降解，污染和感染； 4提取好的核酸若不立即进行检测，应于-20℃保存 RT-PCR检测 1）反应体系配制（25ul体系） （在专门的生物安全柜中进行）： 使用试剂盒：QIAGEN one step RT-PCR kit（210212） RNase free water 11.9ul 5×RT-PCR缓冲液 5ul 10mM dNTP 1ul Enzymix 1ul RNasin 0.1ul 上游引物 (20uM) 0.5ul 下游引物 (20uM) 0.5ul 合计 20ul 对每一个建立的反应确定反应数（n=拟进行的PCR管数，包括阴性，阳性对）。考虑到阴性无模板对照，阳性对照，误差，制备过量的反应混合物是必要的。具体如下： （1）如果包括对照，样品的数量（n）为1到14，那么N=n+1； （2）如果包括对照，样品的数量（n）大于15，那么N=n+2。 2）将上述反应液混匀，分装到0.2mL PCR小管中，每管20μL，分别做好标记。 3）加RNA模板（在核酸提取区） 将上述分装好的PCR小管分别加入模板。首先加入阴性对照管（5μL无菌水），然后分别加标本RNA（每管5μL），最后加入阳性对照RNA（每管5μL）。 反应条件： 1、 60℃ 1分钟 2 、42℃ 10分钟 3、 50℃ 30分钟 4 、95℃ 15分钟 5 、94℃ 30秒 6、 50℃ 30秒 7 、72℃ 1分钟 回到第5步 40个循环 8、 72℃ 10分钟 9、end 电泳并观察结果： 提前用1×的TBE缓冲液配制1.5-2%Agrorose gel ，胶块凝固后将其放置在加有1×TBE缓冲液的电泳槽中，电泳缓冲液必须淹没胶块。电泳液最好新鲜配制。 PCR结束后，各取5ul PCR产物和1ul 6×Lodding Buffer混匀，点样，同时加DL2000 Marker 5ul ，阴、阳性对照； 电泳电压：120V 时间：胶块的体积和浓度都对电泳时间有影响，一般30min-1h。根据Lodding Buffer中的溴芬兰指示剂的位置来判断电泳的程度，一般蓝色指示条带泳动到胶块2/3 位置处，就可以观察结果了 Real-time PCR检测 体系的配制（25ul体系）： RNase free water 5.75ul 2×Master Mix 12.5ul RT-Mix 0.25ul Primer-1（40uM) 0.5ul Primer-2 (40uM) 0.5ul Probe (10uM) 0.5ul 上述成分混匀，每管加入5ul待检样品的核酸，封盖，上机。 样品多时，同RT-PCR体系的配制方法，混匀分装。 必须同时设定阴、阳性对照和空白对照 反应条件： 1、60℃ 5min 2、50℃ 30min 3、95℃ 15min 4、95℃ 15s 5、55℃ 30s 6、72℃ 30s 7、 read plate 8 、goto step4，for 45 cycles 9、72℃ 5min 10、read plate 11、