改良消减杂交技术用以筛选差异表达非编码小RNA的应用初探.pdfVIP

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2016-05-12 发布于安徽
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改良消减杂交技术用以筛选差异表达非编码小RNA的应用初探.pdf

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生物技术通报 ·研究报告· BIOTECHNOLOGY BULLETIN 年第期 2013 2 改良消减杂交技术用以筛选差异表达非编码小 RNA 的应用初探 1 1 2 1 1 1 王燕彭莉萍陈锦珍刘星罗镇明周天会（1. 遵义医学院珠海校区生化与细胞分子生物学教研室，珠海 519041 ；2. 遵义医学院第五附属医院普外科，珠海 519041）摘要：旨在构建一种能快速、有效检测不同细胞中差异表达的非编码小RNA 的方法。以乳腺癌细胞株MCF7 和非癌乳腺上皮细胞HBL100 为材料，用RNA 分离试剂盒分离获得长度为18-100 nt 的RNA 片段，3端添加poly （A ）尾后利用smart 技术进行反转录，在反转录体系中加入生物素标记的dATP ，得到单链cDNA ；结合生物素- 磁珠分离技术将cDNA 与待测RNA 进行消减杂交并以U6 为内参验证消减结果；最后利用巢式PCR 扩增杂交产物，PCR 产物插入T 载体后，挑取阳性克隆进行测序。结果显示，总RNA 按不同大小片段分离富集后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，于100 nt 以下显示较亮条带；以U6 为内参检测杂交效率，杂交后U6 于33 个循环时可见少量扩增条带；杂交产物经巢式PCR 和电泳表明在 100 nt 范围内有明显条带，得到差异表达的非编码小RNA 。经过改良的消减杂交方法可以快速、有效的检测不同标本中差异表达的非编码小RNA 。关键词：非编码小RNA 消减杂交乳腺癌细胞 Primary Investigation of Improved Subtractive Hybridization that Can High Efficiently Screen Differentially Expressed Small ncRNA 1 1 2 1 1 1 Wang Yan Peng Liping Chen Jinzhen Liu Xing Luo Zhenming Zhou Tianhui （1. Zhuhai Camp us of Zunyi Medical College Room ，Biochemistry and Molecular Biology of the Cell ，Zhuhai 51904 1 ；2. Fif th Dep artment of General Surgery ，the Aff iliated Hosp ital of Zunyi Medical College ，Zhuhai 51904 1 ） Abstract: The purpose of this paper is to build a new method that can detect the differences of small non-coding RNAs in breast cancer cells. This paper adopt the methods of isolating the