人鸟氨酸脱羧酶抗酶1突变基因的克隆及原核表达.pdfVIP

生物技术通报 BIO TE CHN OLOG Y B ULLETIN 2010 2 1 1 1 1, 2 蔡富强 韩钰 王艳林 1 2 ( , 443002; , 443002) : 克隆人鸟氨酸脱羧酶抗酶 1(H omo sap iens ornithine decarboxylase antizym e 1, HOAZ1)开放性阅读框 1核糖体 移码位点 失的突变基因, 构建突变基因的原核表达质粒, 分离纯化其原核表达的重组蛋白采用巢式PCR和重叠延伸 PCR技术, 从人非小细胞肺癌细胞株 A549的 cDNA 中获得人类鸟氨酸脱羧酶抗酶 1开放性阅读框 1核糖体移码 ( 1RF) 位点 失突变的基因序列(DMHOAZ1) 将该序列克隆到原核表达载体 pET28a( ) 后, 转化表达菌 Rosseta( DE3) 感受态 细胞阳性克隆用 IPTG诱导重组蛋白表达, 然后在尿素变性条件下经 N iNTA树脂亲和层析纯化重组 HOAZ1原核表达和 纯化的 HOAZ1重组蛋白用 W estern Blot鉴定结果显示, 成功获得 HOAZ1开放阅读框中 1RF位点 失的突变基因和该突 变基因的原核表达质粒 pET28a( ) /DMHOAZ1;用 pET28a( ) /DMHOAZ1转化大肠杆菌后, HOAZ1可被 IPTG 诱导性 高表达, 且表达量随诱导时间延长递增; 原核表达的HOAZ1可用 N iNTA树脂亲和层析有效纯化建立了原核表达和分离纯 化HOAZ1蛋白的试验方法, 为进一步研究HOAZ1的功能和临床应用奠定了基础 : 鸟氨酸脱羧酶抗酶 1 突变 原核表达 Cloning andProkaryoticExpression ofMutatedHuman OrnithineDecarboxylase Antizyme 1 1 1 1, 2 CaiFuqiang Han Yu W angYanlin 1 2 ( Institute of M olecular B iology,M edical Colleg e, Yichang 443002; Three Gorg es University, Yichang 443002 Abstrac:t Itwas to clone hum an orn ithine decarboxylase antizym e 1 w ith deletedm utation in 1 ribosomal fram e shifting( 1RF) site(DMHOAZ1), and to estab lish am ethod for prokaryotic expression and purification of theHOAZ1. NestPCR and overlapp ing extensionPCR w ere used to am plify DMHOAZ1 from cDNA of hum an nonsm all lung cancer cell line A549. DMHOAZ1w as then in