人转录因子hASH4的表达纯化及DNA结合活性.pdfVIP

生物技术通报 ·研究报告· BIOTECHNOLOGY BULLETIN 年第 期 2014 6 人转录因子 hASH4 的表达纯化及其 DNA 结合活性 苏琢磊  楼田甜  王远东  季朝能 （复旦大学生命科学学院 遗传学研究所，上海 200433） 摘 要 ： hASH4 蛋白所属的HLH 转录因子家族在调节基因表达，调控细胞周期，决定细胞分化中起了重要作用。有研究 表明hASH4 蛋白可能与皮肤的分化发育有着密切的关系，但具体机制不明。成功构建了pET28b-hASH4 表达质粒，并在大肠杆 菌BL21 （DE3 ）中诱导表达。经过对温度、时间、IPTG 浓度等表达条件的优化，确定在37 ℃下1 mmol/L IPTG 诱导表达4 h 可 达到最佳表达效果，并通过亲和层析和弱阳离子交换层析纯化蛋白，得到了电泳纯的目的蛋白。通过非放射性凝胶滞留试验发现 hASH4 蛋白单体只具有非特异性的DNA 结合活性，而不具有特异性的DNA 结合活性，推进其在体内的转录因子功能可能需先形 成异源二聚体或多聚体才能进一步特异性结合DNA 进而作用于下游基因。研究结果为hASH4 蛋白的功能和作用方式提供了线索， 并为其进一步的结晶条件筛选、晶体结构解析和功能研究奠定基础。 关键词 ： 螺旋-环-螺旋 碱性/ 螺旋-环-螺旋 hASH4 DNA 结合 特异性结合 非特异性结合 ， Expression Purification and DNA Binding Activity of Human Transcription Factor hASH4 Su Zhuolei Lou Tiantian Wang Yuandong Ji Chaoneng （Institute of Genetics ，School of Lif e Science ，Fudan University ，Shanghai 200433 ） Abstract:  hASH4 is a member of Helix-Loop-Helix （HLH ）proteins which are an important group of transcription factors that exert such a determinative influence on a variety of cell proliferation, determination and differentiation from yeast to human. hASH4 has been reported closely related to skin differentiation and development, but the exact mechanism is unknown. In this study, the expression plasmid of pET28b- his- hASH4 was restructured and successfully expressed in BL21 （DE3 ）. After the optimization of temperature, time, IPTG concentration of expression, we ascertain that 1mmol/L IPTG expressed 4 hours at 37 ℃ can get the best ex