绵羊Myostatin基因敲除及转录调控的研究.pdf

摘要 达的肌肉生长负调控因子。Myostatin基因超量表达可以导致动物肌肉萎缩，而其突变则使动物产 生双肌现象。Myostatin基因敲除小鼠的体重比对照组提高30％，肌肉量增加一倍，但对生存和 基因的畜禽尚未成功建立。本试验选用产仔率较高的中国小尾寒羊为研究对象，从小尾寒羊基因 组中扩增山4．6kb和O．8kb Myostatin基因片段。分别作为打靶载体的5’同源长臂和3’同源短臂， 料分离并纯化了小尾寒羊原代骨骼肌成肌细胞，为通过基因打靶获得Myostatin基因第三外显子 部分序列缺失的绵羊体细胞和利用体细胞克隆建立Myostatin敲除的绵羊模型提供了条件，为进 敲除改良畜禽生长性能的可能性奠定了基础。本试验在打靶载体标记基因和报告基因的两端引入 了loxP序列，以期利用Cre／loxP系统去除筛选基因和报告基因，以排除筛选基因和报告基因对 Myostatin功能研究的影响，也为生产能够安全食用的绵羊新品种奠定基础。 区一些重要调控基元的比较表明，各种调控元件在数量和位置上既存在保守性，也存在变异性。 为了进一步鉴定以上调控元件，以EGFP为报告基因，构建了各种长度的野生型 小鼠骨骼肌成肌细胞系，对各种情况下EGFP的瞬时或稳定表达进行了荧光强度定量分析。结果 片段的转录调控活性最高。然而将绵羊1．2kbMSTNProtEGFP载体转染绵羊成纤维细胞后计未 E5和E7，尤其是E3、E5和E7，对绵羊1．2kb Myostatin启动子的转录调控活性具有重要影响。 E3、E4和E5非常邻近的序列位置暗示了它们可能是共同作用于相应的转录因子，以族的形式维 持DNA．蛋白结合的稳定性。E3和E5同时突变或E3、E5和E7同时突变并未比单独突变其中一 个元件表现出显著差异。对稳定转染绵羊I．2kb 达的研究表明，细胞生长密度的增加可以反馈性抑制Myostatin的转录和表达，而且Myostatin在 C2C12分化状态F的转录和表达量比成肌状态时显著升高。然而，对于稳定转染1．2kb MSTNProE”…-EGFP(E3、E5和E7同时突变)载体的C2C12细胞，EGFP的转录和表达量并 未表现出分化和生长状态时的差别。这一结果暗示了MyoD可能是通过E-box引起Myosmfin在 C2C|2分化和生长状态时转录和表达差异的原因，因为MyoD是参与成肌分化的一个主要因素。 绵羊1．2kb 外一个MEF2元件(MEF2-2)没有产生预期的效应。另外，在我们的试验中还鉴定了对绵羊 Myostatin启动子转录调控活性具有显著影响的另外一个肌肉特异性调控元件MTBF。GRE调控 元件的突变使绵羊1．2kb Myostatin启动子的转录调控活性显著降低，一定剂量的糖皮质激素(地 塞米松)可以显著增加绵羊1．2kb野生型Myostatin启动子的转录调控活性，丽对GRE元件突变 后的Myostatin启动子影响不显著，暗示了糖皮质激素可能通过作用于GRE元件促进绵羊 M，,ostatin的转录和表达，进而抑制肌肉的发育。糖皮质激素受体抑制剂RU-486能够显蓑抑制糖 皮质激素对绵羊1．2kb野生型Myostatin启动子转录调控活性的促进效应，意味着糖皮质激素和 GRE调控元件的作用是通过糖皮质激素受体介导的。PRE元件的突变或孕激素的添加均使绵羊 1．2kb 分析的PRE元件可能是非孕激素作用的另一元件，而孕激素对绵羊1．2kb Myostatin启动子转录 调控活性的明显降低可能是由于孕激素的间接作用。 关键词：绵羊，Myostatin，基因敲除，转录调控，调控元件。骨骼肌 lI Abstract named memberofthe GDF8)，a Myostatin(MSTN。also transforminggrowthfactor]B(TGF-13) skeletal andacts of