第七章细胞培养基本常用技术重点分析.ppt

第七章 细胞培养中的基本方法 　 一、细胞培养操作基本要领和要求 防止污染是决定培养成败的首要条件。 培养前准备 准备各种所需物品（宁多勿 少）；用品置于场地，然后消毒 操作野消毒 现多用紫外线灯灭菌，效果很好。 洗手和着装 洗手用75%酒精或0.2%的新洁尔灭 火焰消毒 　在无菌环境进行培养或做其它无菌 操作时，首先要点燃酒精灯。以后 一切操作,如安装吸管帽、启开或 封闭瓶口等，都需要经过火焰烧灼 进行。 培养操作 动作准确敏捷 不用手触及已消毒物品 操作面布局合理 操作保持一定顺序 组织或细胞在未做处理前或培养液在未用前，勿过早暴露在空气中；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口。 防止各种用液的交叉污染 不向操作野讲话或咳嗽 二、细胞计数 用细胞计数法测定细胞生长动力学是 目前采用的最普遍的方法。 　　　血细胞计数板人工计数 　　　细胞计数器 血细胞计数板：常用的是改良的纽巴氏 (Neubauer)血细胞计数板。 具体操作程序如下： 1、取血细胞计数板和盖玻片，用75%酒精擦净。将盖玻片放于计数板上。 2、用滴管取混合均匀的细胞悬液，滴入计数室内。要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。滴加细胞悬液后约静置1分钟后则可以进行计数。 3、统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，分别数出四角的四个大格（每个大格含有16个中格）中的细胞数。 对压边线细胞：计上不计下，计左不计右 计算：一般以每毫升含细胞数来表示 大方格的面积为1mm2，室深为0.1mm，则体积为0.1mm3。推算得0.1mm3×104，才为1ml体积。所以计算公式为： 细胞悬液的细胞数）/ml 　＝（?四个大格子细胞数/4)?×104?×稀释倍数 计数中，如果细胞悬液的细胞浓度过高，必须稀 释后再计；如果细胞数太少,可离心浓缩后再计。 每个细胞悬液至少滴样两次求平均值。 用细胞计数板计数时应注意的事项: ﹙1﹚不要漏计，不要重复 ﹙2﹚细胞悬液应混合均匀 ﹙3﹚浓度不可过高也不可过低。 三、细胞生长曲线的绘制 细胞生长曲线(cell growth curve)是观测细胞在一代生存期内的增生过程的重要指标，可根据细胞生长曲线分析细胞增殖速度，确定细胞传代、细胞冻存或具体实验的最佳时间。 它以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标作坐标图。 制作方法： 1.培养细胞 首先在2４孔培养板内分别接种相同数量的细胞。计数并记录接种的细胞悬液之密度。接种时间记为0 h。 2.计数细胞密度 从接种时间算起，每隔24h计数３孔内的细胞密度，算出平均值。为提高准确率，对每孔细胞可计数2～3次。如此操作至第七天结束。 3.绘制曲线 以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标，将全部结果在坐标纸上绘图，即得所培养细胞的生长曲线。 四、活细胞的染料排除检测法 原理：由于死细胞的细胞膜通透性发生改变，某些染料可大量进入却不被排出，因而细胞呈色。而活细胞反之，能排出进入细胞内的染料，因而不易着色。此法的原理即是利用死、活细胞对染料的不同反应而区分开两种细胞。 最常用的为“台盼蓝排除检测法” (1)0.4％台盼蓝溶液的配制： 称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，40C保存。使用时。用PBS稀释至0.4%。即成工作液。 (2)活体染色与细胞计数 ①将1滴细胞悬液(贴壁细胞可经0.25％胰蛋白酶溶液消化后，吹打制成细胞悬液)与2滴台盼蓝液混合后，滴入细胞计数板。 ②2min后，在显微镜下计数至少200个细胞。未着色的为活细胞，呈蓝色的为死细胞。计算活细胞百分比。 注意事项:台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。否则，部分活细胞也会着色，会干扰实验结果。 五、细胞活力测定的MTT比色法 原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能将染料MTT(二甲基噻唑二苯基四唑溴盐)转变为不可溶性的紫色结晶，后者被DMSO（或酸性异丙醇）溶解后所呈现的色度(用OD值表示)反映出活细胞的代谢水平。死亡细胞则无此酶活性。 1.MTT溶液的配制 用PBS液(pH7.2)或者生理盐水将MTT配成5mg／m1的溶液。（用0.2μm滤膜过滤）。 保存：于4℃避光保存。可用2周。若暂不用，可冻存。 2.实验过程 将细胞培养于96孔培养板。 按不同实验要求处理细胞。 每孔加入15-20μlMTT液，继续培养3～4h。 吸去培养液，每孔加入200μlDMSO,在微型振荡器振荡5min,充分溶解混匀。 在酶标仪上测定光吸收。测定波长为 490nm，以只加培养液的的培养皿为空白对照。 3.结果分析 细胞存活率= 4.注意事项 (1)高浓度血