第7章高效液相色谱详解.ppt

(六)亲和色谱法（AC）简介 亲和色谱是利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性亲和力，进行选择性分离的一种方法。它通常是在载体表面先键合一种具有一般反应性能的所谓间隔臂（如环氧、联氨等）；随后，再连接上配基（酶、抗原或激素等）。这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子相互作用而被保留，没有这种作用的分子不被保留。 （七）分离类型的选择 1．根据相对分子质量选择 分子量低的样品，其挥发性好，适用于气相色谱。液相色谱类型（液一固、液一液、及离子交换色谱）最适合的相对分子质量范围是20O～2000。分子量大于2000样品，则用尺寸排阻法为最佳。 2．根据溶解度选择 弄清样品在水、异辛烷、苯、四氯化碳、异丙醇中的溶解度是很有用的。如果样品可溶于水，属于能离解物质，以采用离子交换色谱为佳；如样品可溶于烃类（如苯或异辛烷），则可采分配色谱。  液相色谱分离类型选择参考表 溶于水——排阻色谱，水为流动相 相对分子质量 ＞2000 不溶于水——排阻色谱，非水流动相 同系物——分配色谱 不溶于水 异构体——吸附色谱 样品 分子大小差异——排阻色谱 反相液一液色谱 相对分子质量 溶于水，不离解 ＜2000 排阻色谱，水为流动相 碱——阳离子交换色谱 溶于水，可离解 酸——阴离子交换色谱 溶于水， 离子与非离子—反相离子对色谱 用液一固吸附色谱；如样品溶解于四氯化碳，则多采用常规的分配和吸附色谱分离；如样品既溶于水又溶于异丙醇时，常用水和异丙醇的混合液作液一液分配色谱的流动相，以憎水性化合物作固定相。 * * * * * * * * * （二）流动相 由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是： （1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。 （2）溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。 对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。 (3)高纯度。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕量杂质将使截止波长值增加50-1OOnm。 (4)化学稳定性好。不能选与样品反应或聚合的溶剂。 (5)低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙腈等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。 第4节 高效液相色谱法的主要类型及选择 （－）液-液分配色谱法（LLPC） 在液-液色谱中，流动相和固定相都是液体，它能适用于各种样品类型的分离和分析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离子型的化合物。 1. 分离原理 液液分配色谱的分离原理与液液萃取相同，都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同。液液色谱的分配是在柱中反复多次进行，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分。 2. 固定相 由于液液色谱中流动相参与选择竞争，因此，对固定相