第三章分子荧光光度法教案.ppt

* 第三章 分子荧光光度法 §3-1 分子荧光概述 分子荧光法的分析一般都在溶液中进行，如前所述每个分子都具有一系列严格的分立能级： 图中S0表示分子的基态，S1、S2分别为第一激发单重态和第二激发单重态；T为激发三重态；基态和激发态都存在几个不同的振动能级。P.82 物质吸收了电磁辐射并发射出荧光的过程中大致会经历以下几个过程： 1.激发： 通常在室温下，大部分分子处于基态的最低振动能级，含有偶数个电子且自旋配对，处于基态单重态(sinlet state；Pauli原理)；当其吸收一定频率的电磁辐射(光量子)后电子可发生能级跃迁至第一激发单重态(S1)，这一过程称为激发。 2.去活化过程： 处于激发态的分子是不稳定的，可通过几种不同的途径回到基态，这一过程称为去活化。去活化过程主要有以下几种： (1)振动驰豫： 溶液中分子之间通过碰撞，受激溶质分子向溶剂分子转移过剩的振动能量，以10-13~10-11秒的速度，通过非辐射跃迁而降至同一电子能级的最低振动能级。这一过程称为振动驰豫。 (2)荧光发射： 处于第一激发单重态最低振动能级的分子，有几种可能的去活化过程发生，其中之一是以10-9~10-7秒左右的时间内发射光量子回到基态的各振动能级，这一过程称为荧光发射。 (3)内转移： 激发态分子从较高的电子能级转换至较低的电子能级。内转移过程的速度很大程度上决定于产生此过程所包含的能态之间的相对能量差。 当两电子能级非常靠近以至其振动能级有重叠时，内转移就容易发生。 如激发单重态S1的高振动能级常与S2的低振动能级重叠，两激发态的位能一样，内转移过程即容易发生，一般需10-13~10-11秒的时间。 (4)体系间的系间窜跃： 受激分子从激发单重态转至能量较低的激发三重态的过程称为系间窜跃。 如果两个能态的振动能级重叠时，这种跃迁的几率较大；这些处于激发三重态的分子，继续通过辐射光能而回到基态单重态的各振动能级，所发出的辐射称为磷光。 由于不同物质的分子结构及分析时所处的化学环境不同，因此各去活化过程的速度也就不同。如果荧光发射过程比其他去活化过程的速度快，就可看到荧光发射现象；相反，则看不到荧光，或其强度减弱。 任何荧光化合物都具有两个特征光谱：激发光谱和发射光谱。它们是荧光定性和定量分析的基本参数和依据。 §3-2 荧光分析法定量依据 一.激发光谱 以激发光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘得的谱图称荧光化合物的激发光谱。 绘制激发光谱曲线时，在荧光的最大发射波长处，改变激发光波长来测量相应的荧光强度。 激发光谱与吸收光谱不仅形状相同,而且波长位置也一样,这是因为物质分子吸收能量的过程就是被激发的过程. 二.荧光发射光谱 简称荧光光谱或发射光谱。如果将激发光波长固定在最大激发波长处，然后扫描发射波长，测定不同发射波长处的荧光强度，即得到荧光发射光谱。下图为萘的激发光谱、荧光发射光谱和磷光发射光谱。 激发光谱和荧光发射光谱的特点： (1)荧光发射光谱与激发波长无关，如前所述，无论引起物质激发的波长是?1还是?2，但荧光发射波长都为?3。 这是由于分子吸收了不同能量的光子可由基态激发到不同的电子激发能级而产生几个吸收 带；由于较高激发态可通过内转换及振动弛豫回到第一激发态的几率很高，远远大于由高能级激发态直接发射光子的速度。 故在荧光发射时，无论用哪一个波长的光辐射来激发，电子都从第一激发态的最低振动能级返回到基态的各个振动能级，所以荧光发射光谱与激发波长无关，只出现一个荧光谱带。 (2)荧光光谱与吸收光谱呈镜像对称关系 将某一荧光物质的荧光光谱和它的吸收光谱对比时，将发现这两个光谱间呈镜像对称关系。 吸收光谱是物质分子的外层电子由基态激发至第一电子激发态的各振动能级所致，其形状决定于第一电子激发态中各振动能级的分布状况； 荧光光谱是激发态分子从第一电子激发态的最低振动能级回到基态中各振动能级所致，其形状决定于基态中各振动能级的分布状况； 而第一电子激发态中各振动能级的分布与基态中各振动能级的分布相类似，因此荧光光谱与吸收光谱形状相似，并呈镜像对称关系。 三．荧光和分子结构的关系 产生荧光的分子必须具备下列条件： (一)物质分子必须具有与所照射的光辐射相同频 率的吸收结构，才能吸收激发光。 (二)吸收了与其本身特征频率相同的能量之后， 必须具有一定的荧光效率。 荧光效率也称为荧光量子产率，表示物质发射荧光的本领，为发出荧光量子数和吸收激发光量子数的比值。 ?值一般＜1，如罗丹明B的乙醇