DNA重组技术的基本工具-.ppt

大连市二十四中学 生物组 现代生物科技 专题1 基因工程 基因工程概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。 基因工程的别名 操作环境 操作对象 操作水平 基本过程 实质 结果 基因拼接技术或DNA重组技术 生物体外 基因 DNA分子水平 剪切 → 拼接 → 导入 → 表达 基因重组 定向地改造生物的性状，获得人类所需要的品种。 基因工程概念 科技探索之路(阅读） 二、技术发明使基因工程的实施成为可能 一、基础理论和技术的发展催生了基因工程 工欲善其事，必先利其器！ 你认为完成基因工程需要哪些工具？ 1.1 DNA重组技术的基本工具 “分子手术刀” —— 限制性核酸内切酶 分布：主要在原核生物中。 特点：特异性 识别特定序列（双链DNA分子的某种特定核苷酸序列），切割特定位点（每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键）。 如EcoRI,识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。 结果：产生末端（黏性末端、平末端） 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将DNA分子切断。目前已发现的限制酶有4000多种。 被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。 黏性末端 GAA TTC CTT AAG G AATTC CTTAA G EcoRI （在G与A之间切割） 黏性末端 中轴线 中轴线两侧的双链DNA的碱基反向对称 当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。 平末端 CCC GGG GGG CCC CCC GGG GGG CCC SmaI （在G与C之间切割） 平末端 中轴线 中轴线两侧的双链DNA的碱基反向对称 “分子缝合针” —— DNA连接酶 （1）种类： （2）作用部位： 两类 E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 磷酸二酯键 （3）连接酶的作用：将互补配对的两个黏性末端或平末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。 连接黏性末端 连接黏性末端和平末端 DNA聚合酶和DNA连接酶有何相同和不同点？ 相同：DNA连接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯键。 不同：（1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。 （2）DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。 “分子运输车” ——载体 作用：将外源基因送入受体细胞。 条件： 能在受体细胞内自我复制或整合到染色体DNA上，随之同步复制。 具有一个或多个限制酶切点。 具有某些标记基因。 必须是安全的，大小合适 种类：质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒。 大肠杆菌 DNA 质粒 抗生素抗性基因 是一种裸露的，结构简单的，独立于细菌拟核DNA以外的具有自我复制能力的小型环状双链DNA分子。大小约为数千碱对。常有1 - 3个抗药性基因，以利于筛选。 基因工程中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA？ 细菌中限制酶之所以不切断自身DNA，是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，对于外源入侵的DNA可以降解掉。生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。