1亲和色谱2010分析报告.pptVIP

亲和色谱 亲和色谱的特点 ①选择性高、特异性极强 ②操作条件温和 ③回收率高 亲和色谱的局限性 ①普遍性、通用性不够 ②费用高 1 亲和作用的本质 生物分子间的这种特异性相互作用称为生物亲和作用（bioaffinity）或简称亲和作用（affinity）。 利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理进行生物物质分离纯化的技术称为亲和纯化（affinity purification）。 亲和作用的分子（物质）对可以是：大分子-小分子，大分子-大分子，大分子-细胞，细胞-细胞。 具有亲和作用的分子对之间具有“钥匙”和“锁孔” 的空间结构关系。 亲和结合作用，至少存在3个对应官能团相结合： 静电作用 氢键 疏水相互作用 配位键 弱共价键 2 亲和作用体系 将亲和体系中的一种分子与固体粒子共价偶联，可特异性结合另一种分子（目标产物） ，使其从混合物中高选择性地分离纯化。 一般将被固定的分子称为其亲和结合对象的配基（ligand），用L表示。 Keq越大，亲和结合作用越强。Keq一般为104～108 L/mol，最高可达到1015 L/mol 。 表1-1 常用的亲和作用体系 特异性 亲和作用体系 高特异性 抗原----单克隆抗体 荷尔蒙----受体蛋白 核酸----互补碱基链段、核酸结合蛋白 酶----底物、产物、抑制剂 群特异性 免疫球蛋白----A蛋白、G蛋白 酶----辅酶 凝集素----糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体 酶、蛋白质----肝素 酶、蛋白质----活性色素（染料） 酶、蛋白质----过度金属离子 酶、蛋白质----氨基酸（组氨酸等） 3 亲和色谱填料 亲和吸附作用是在特定配基的存在下实现的，需根据目标产物选择适当的亲和配基修饰固定相粒子，制备所需的亲和吸附介质。 少数特殊情况如Sephadex凝胶可亲和吸附伴刀豆球蛋白A 。 在利用亲和色谱技术纯化目标产物时，商品化的亲和吸附介质往往不能满足特殊目标产物的需要，有必要自制亲和吸附介质。 亲和色谱填料的制备过程一般包括：载体（carrier、support）的选择、载体的活化和配基的连接。 载体的活化和配基的连接 溴化腈活化法 环氧基活化法 部分商品化的色谱填料见表1-2。 4 重要的亲和配基 A蛋白 protein A为分子量约42 kD的蛋白质，与IgG具有很强的亲和作用，A蛋白分子上含有5个Fc片段可结合部位。 A蛋白可作为各种抗体的亲和配基，但不同抗体的结合常数有所不同。 A蛋白也可用于分离抗原-抗体的免疫复合体。 凝集素 凝集素（lectin）是与糖特异性结合的蛋白质（酶和抗体除外）的总称。 伴刀豆球蛋白A（concanavalin A，con A） 可用做糖蛋白、多糖、糖脂等含糖生物大分子的分析、纯化。 三嗪类色素 利用色素为配基的亲和色谱法又称色素亲和色谱（Dye-ligand affinity chromatography）。 Triazine dyes是一类分子内含有三嗪环的合成染料，与NAD+的结合部位相同，又称为生体模拟色素（biomimetic dye）。除脱氢酶和激酶外，三嗪类色素还与血清白蛋白、 干扰素、核酸酶和糖解酶 等具有很高的亲和力。 Cibacron Blue F3GA ： 过渡金属离子 Cu2+，Ni2+，Zn2+和Co2+等过渡金属离子可通过与iminodiacetic acid（IDA）或Nitrilotriacetic acid（NTA）形成螯合金属盐固定在固定相粒子表面，用做亲和吸附蛋白质的配基。 这种利用金属离子为配基的亲和色谱一般称为金属螯合色谱（metal chelate chromatography）或固定化金属离子亲和色谱（immobilized metal affinity chromatography，IMAC）。 抗体 利用抗体为配基的亲和色谱又称免疫亲和色谱（immunoaffinity chromatography）。抗体与抗原之间的Keq一般为107～1012 L/mol。 利用免疫亲和色谱法是高度纯化蛋白质类生物大分子的有效手段。 其他