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* * 聚醚类抗生素盐霉素的高效毛细管电泳—电导分离检测 答辩人：罗洁 指导老师：谢天尧 盐霉素（salinomycin）又名沙利霉素、球虫粉、优素，属于聚醚类抗生素。在实际应用中，常用其钠盐，即盐霉素钠，分子式为C42H69O11Na,分子量为772.99。结构式比较复杂，可示意为： 色态：白色或浅棕色无定形粉末，无味 溶解性：微溶于水，易溶于低级醇、乙醚等有机溶剂 稳定性：在中性或碱性环境中稳定，在高温120℃时不失活，在酸性介质中不稳定。 应用现状： 国内外广泛用来防治牛、羊、鸡、兔的球虫病；同时可作为饲料添加剂使用，促进畜禽生长发育和提高饲料利用率。但是聚醚类抗生素使用剂量的安全范围较窄，盐霉素对肉鸡的ＬＤ５０为１５０毫克／千克体重。其在饲料中的含量稍大即可使动物的增重减慢，饲料转化率降低。 现有的检测方法：高效液相色谱柱后衍生化法 高效液相色谱柱前衍生化法 分光光度法 本实验采用毛细管电泳—电导检测法（CE—CD）对盐霉素进行分离检测 实验主要内容： 分离条件的选择 重现性、线性范围和检测限 样品测定 缓冲体系种类及其浓度 进样方式 分离电压 提取方法 分离条件的选择——缓冲体系种类及其浓度 缓冲体系种类的选择： Tris(三羟甲基氨基甲烷 )－硼酸：盐霉素得不到检测 Tris：盐霉素得不到检测 醋酸钠－氨水：可检测到盐霉素 Tris－HAc－Cit(柠檬酸 )：可检测到盐霉素， 且分离度和灵敏度最佳 缓冲体系中各组分浓度的确定： 经过系列试验后发现， Tris－Hac－Cit体系中三种组分的浓度对盐霉素测定的分离度和灵敏度都有所影响 分离条件的选择——缓冲体系种类及其浓度 Tris：主要用于调节缓冲容量以及pH值，但当Tris浓度太大时，水峰后容易形成正峰，影响对盐霉素蜂的测定（图1）。其浓度的大小对灵敏度影响不大。 Hac：浓度增加可避免水峰后的正峰出现，但随着浓度的继续增加，水峰形成拖尾，对盐霉素峰造成干扰（图2）。灵敏度在Hac浓度为1 mmol/L到5 mmol/L之间，随Hac浓度的增加而降低。 图1 图2 Cit：主要用于调节PH值，随着Cit的加入，PH降低，水峰拖尾加重，对盐霉素峰造成干扰。灵敏度在Cit浓度为0.05mmol/L到0.4mmol/L之间，随Cit浓度的增加稍微降低。 分离条件的选择——缓冲体系种类及其浓度 综合上述影响因素，确定12 mmol /LTris+1 mmol/L醋酸+0.2 mmol/L柠檬酸为电泳缓冲体系。该缓冲体系，基线平稳，并且在保证该检测方法的灵敏度的同时，不形成正峰，水峰对盐霉素峰的基本无干扰（图3）。 图3 分离条件的选择——进样方式 分别用纯水，1：4甲醇水溶液，1：1甲醇水溶液，无水甲醇制备进样样品，随着甲醇含量的增加，水峰出峰时间推迟，并且与盐霉素的出峰时间差增大，分离度提高。 图4：进样样品中甲醇含量与盐霉素峰面积的关系图 本实验采用 1：1甲醇水溶液 制备进样样品，以取得较高的灵敏度。 分离条件的选择——进样方式 电动进样： 重力进样： 盐霉素峰面积增加，但峰形不对称； 必须用缓冲溶液制备进样样品； 所得到的谱图往往因为水峰后存在正峰而 难以对盐霉素峰进行测定 峰面积虽然减小，但峰形佳； 用1：1甲醇水溶液制备进样样品，分离效果理想； 采用重力进样20 s，可得到较好的重现性。 分离条件的选择——分离电压 50 s 6：22 5：32 8Kv 40 s 5：00 4：20 10Kv 34 s 4：08 3：34 12Kv 出峰时间差 盐霉素峰出峰时间 水峰出峰时间 电压 分离电压对出峰时间以及出峰时间差的影响 从上表可看出，随着电压的降低，水峰和盐霉素峰的出峰时间都推迟，并且两者的出峰时间差逐步增大。 在保证水峰不干扰盐霉素峰的前提下，选择使用 12 Kv作为分离电压，可实现在5分钟之内对盐霉素进行检测。 重现性、线性范围和检测限 重现性：在上述选定的实验条件下，对盐霉素的标准溶液连续进行6次测定，出峰时间和峰面积RSD为0.7%和2.8% 校正曲线上图，检测线性范围为：5 mg/L~100 mg/L，，峰面积S与浓度C（mg/L）的回归方程为：S=75.5C-162，R=0.9996 检出限（S/N=3）为1mg/L。 样品测定 四种提取方法 方法一：准确称取0.15 g盐霉素饲料添加剂，倒入样品瓶中，加入5.00 ml 1：1甲醇水溶液，密封，超声10分钟后，取上层清液于4000 r/min离心机离心1