酶学技术分析报告.pptVIP

第六章　 酶学分析技术 一、酶的结构和分类 酶是由活细胞合成的、对其特异性底物起高效催化作用的蛋白质。是机体内催化各种代谢反应最主要的催化剂。 (一)单纯酶 完全由蛋白质组成 (二)结合酶 蛋白质和非蛋白质（辅助因子） 结合酶 = 酶蛋白 + 辅助因子 （二）酶活性单位 酶是极微量的蛋白质，临床化学检验难以直接测定酶蛋白的绝对含量。因为酶是一类催化效率极高的生物催化剂，微量的酶可以催化大量的底物而发生化学反应，所以临床以酶的活性测定来取代酶的含量测定，以酶活性单位来间接表示酶的浓度大小。 第三节 代谢物酶学分析技术 代谢物酶学分析技术是指用酶法分析的方法来测定人体内的代谢物或代谢产物浓度的技术。 （二）常用指示酶及其指示反应 NAD(P)H 或NAD(P)+偶联的脱氢酶（DH）及其指示反应 偶联H2O2的工具酶及其指示反应 第四节 同工酶分析 一、同工酶的概念 同种生物体内催化相同反应的有关酶类。 同工酶应是同一种属中由不同基因或等位基因所编 码的多肽链单体、纯聚体或杂化体，具有相同的催 化功能，但其分子组成、空间构象、理化性质、生 物学性质以及器官分布和细胞内定位不同的一类酶。 1. 免疫抑制法 利用同工酶的某一亚基与相应抗体结合后，酶活性受抑制，而不含这种亚基的同工酶不受影响。故测定加与不加抗体样品中酶活性的差别，可推并且该型同工酶的活性，如在CK同工酶中加入足备的CK-MM抗体，则： CK-MM活性全部被抑制 CK-MB活性抑制50％ CK-BB活性不受影响 第五节 诊断酶学在临床中的应用 血浆、消化液、脑脊液、尿液、羊水中的酶类统称为体液酶。其中血浆酶的测定是临床生化检验的重要组成部分。 一、血浆酶的来源 （一）血浆特异酶 在血浆中发挥特异催化作用的酶称为血浆特异酶，如凝血酶类、纤溶酶类、胆碱脂酶、铜蓝蛋白（CER），LCAT等。 血浆特异酶大都由肝细胞合成，一般以失活或酶原状态和恒定速度释放入血。肝实质病变时，血浆特异酶在血中明显下降，故血浆特异酶常作为肝功能检验的一部分。 三、常用的酶谱 心肌酶谱---AST、LD、CK、CK-MB、CK- MB亚型或CK-MM亚型 肌酶谱---LD、AST及其同工酶、CK-MM亚型 肝酶谱---ALT、LD、γ-GT、ALP、ChE、MAO 肿瘤酶谱---ACP及其同工酶、ALP及其同工酶、 γ-GT及其同工酶、AFU、AMY及其同工酶、LPS 胰酶谱---AMY及其同工酶、LPS、弹力蛋白酶-1、 磷脂酶A2 重点内容 名词解释 酶活性单位的表示方法及意义 米曼方程表达式； Km值的临床应用与意义 酶偶联法的原理 同工酶、工具酶的定义 （一）固定时间法 分类： 终点法：在反应进行到预定时间后要终止反应。 两点法：该方法反应时间的预定是从t1～t2 。 定义：测定酶促反应开始后一段时间内底物的减少量或产物的增加量。 特点： 优点是简单。 缺点是难以确定反应时间段酶促反应是否处于线性期。 注意：固定时间法时间段的预定不宜太长，一般以30～60分钟为宜。 （二）连续监测法 原理： 定义：测定底物或产物随时间的变化量，又称为速率法。 该方法每隔一定时间（10s～60s）测定一次底物或产 物的变化量，连续测定多点，然后将测定结果与时间作图 ，绘制反应速度曲线。 该方法是在一定的反应时间区段内（至少9～120s）每隔一定时间（常为2～30s）读取一次吸光度值，连续测定多点（至少4点），然后对吸光度数据作最小二乘法处理，再用线性期内的数据计算单位时间内的反应速率△A/min，最后据式5.7等计算出酶活性。 （5.7） 连续监测法测定酶活性的计算公式 特点： 与定时法相比，属于即时观测，无需停止酶促反应、不需添加其他呈色试剂，且可将多点的测定结果绘图连线，快速、直观查看酶促反应进程，很容易找到呈直线的线性期，检查到是否偏离零级反应； 连续监测法要求不显色而是直接测定底物（或辅助底物即中间底物）或产物量的变化，因此，在测定原理上，可以选择紫外吸收法或生色原显色法； 要求能够准确地控制温度、pH值和底物浓度等，要求仪器具有恒温装置及自动监测功能，半自动及全自动生化分析仪都能满足这些要求 ； 缺点： 要求高，要求能够精确地控制温度、pH值和底