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第8章 基因工程药物 8.1 基因工程药物的发展概况 8.2 基因工程制药的下游技术 8.3 几种重要基因工程药物的研发概况 基因工程制药：指利用重组DNA技术，结合发酵工程、细胞工程、酶工程等现代生物技术研制预防和治疗人类、动物重大疾病的蛋白质药物、核酸药物以及生物制品的一门技术。 8.1 基因工程药物的发展概况 8.1.1 基因工程药物的发展简史与现状 8.1.2 基因工程药物的特点 8.1.3 基因工程药物的研发过程 8.1.1 基因工程药物的发展简史与现状 1973年，Cohen等，tetr和strr成功重组，基因工程拉开序幕 1974年，重组质粒转化大肠杆菌，获得相应抗性 1976年，Genentech公司成立 1982年，授权Eli Lilly公司基因重组动物疫苗－抗眼球病疫苗生产和使用；人胰岛素生产和使用 1984年，凝血因子VIII 1985年，注射用促生长素 1987年，tPA 。。。 基因工程药物现状与前景 2001年，生物技术公司4284家（上市622家），销售总额348亿美元，其中基因药物占70%，250亿美元； 美国，1466家，占55%；销售总额285亿美元，占82；上市公司318家，占55%； 日本 欧洲 表8.1 我国国情 “起步晚，发展快；项目不多，仿制为主；重复生产，后劲不足”。 IL-2，干扰素α，粒细胞集落刺激因子（G-CSF），EPO，生长激素。。。 表8.3 8.1.2 基因工程药物的特点 1、高技术：人才、技术 2、长周期：实验室、中试、临床、规模化生产、市场商品化阶段、监督环节 3、高投入 4、高风险 5、高收益 基因工程药物的优点 1、可以得到天然状态难以获得的生理活性物质，改造成新药 胰岛素 2、使生理活性物质在各种反应器中获得高表达，符合临床和研究需要 3、改造生理活性物质，提高其活性：速效、长效 4、可以挖掘和开发更多的新药，获得新物质 8.1.3 基因工程药物的研发过程 1、实验室研究阶段（discovery，research） 2、基因工程药品的开发阶段（development） 3、基因工程药品的临床试验（commercialization）: Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期临床试验 4、新药申请和上市 8.2 基因工程制药的下游技术 8.2.1 基因工程菌的规模化培养 8.2.2基因工程菌细胞膜的破碎 8.2.3 基因重组蛋白的分离与纯化 8.2.1 基因工程菌的规模化培养 8.2.1.1 重组大肠杆菌培养基 8.2.1.2 基本培养方式 8.2.1.3 培养工艺条件对外源基因表达的影响 8.2.1.4 培养条件对产物活性、存在形式及释放的影响 8.2.1.5 高密度和高表达培养对策 8.2.1.1 重组大肠杆菌培养基 C源、N源、无机盐、微量元素、维生素、生物素等 LB培养基、M9培养基 按组成物质的来源分：合成培养基、天然培养基 按存在状态分：固体、液体培养基 8.2.1.2 基本培养方式 1、分批培养（batch culture）：在一个封闭培养系统内含有初始限制量的基质的培养方法。培养过程从接种开始，经过4个时期：迟滞期、对数生长期、减速期和稳定期。 2、补料分批培养（fed-batch culture ） 3、连续培养（continuous culture） 4、透析培养（dialysis culture） 8.2.1.3 培养工艺条件对外源基因表达的影响 工程菌大规模培养的优化设计和控制对外源基因的高效表达至关重要。 工艺：选择合适的发酵系统或生物反应器。 生物学方面的因素： ①与细菌生长密切相关的条件或因素： 温度、pH值、溶氧、培养基成分 ②表达条件 诱导物、改变温度 ③提高外源基因表达产物的总量： 表达水平、菌体浓度 8.2.1.4 培养条件对产物活性、存在形式及释放的影响 对产物活性和存在形式的影响：温度和pH值 存在形式：包涵体、融合蛋白、分泌型 外源基因在大肠杆菌中的表达形式 表达产物可能存在于：细胞质、细胞周质、胞外培养基中 表达形式：可溶性蛋白、不溶性蛋白 ①包涵体蛋白 ②融合蛋白 ③分泌型外源蛋白 1、包涵体蛋白 包涵体：一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密的聚集在一起形成无膜的裸露结构。 细胞质中较多，较少细胞周质 由蛋白质组成，氨基酸序列正确，空间构象错误，无生物学活性。 包涵体优点： 易于分离纯化 对蛋白酶有较好的抗性 2、融合蛋白 融合蛋白：外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基因阅读框。 受体菌蛋白位于N端，外源蛋白位于C端。 融合蛋白优点： 稳定性增加：杂合构象，不易被水解 具有较高的水溶性和生物学活性 能以较高的效率表达：