质粒DNA的小量快速提取(碱裂解法) S2517实验室 第三组.pptVIP

青春土建 立志精英 质粒DNA的小量快速提取（碱裂解法） S2517实验室 第三小组 2015年11月17日 目录 Content 一、实验目的 二、实验原理 三、实验器材与试剂 四、实验操作 五、思考题 一、实验目的 掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各主要试剂的作用。 注释： 质粒（plasmid）:大小在1kb～200kb之间，结构简单，大多是具有双链闭合环状结构的DNA分子，通常以超螺旋状态存在于许多细菌和酵母菌中。质粒具有不相容性，两种不同的质粒不能共存在同一个宿主细胞中。质粒可在细胞间传递，其在胞内的存在一般对宿主细胞的代谢活动无影响。 SDS:十二烷基硫酸钠,用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及裂解核酸。经SDS处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。 氨苄西林:（2S， 5R，6R)-3，3-二甲基-6-〔（R)-2-氨基-2-苯乙酰氨基〕-7-氧代-4-硫杂-1-氮杂双环[3.2.o]庚烷-2-甲酸三水化合物，为半合成的广谱青霉素。本实验中，大肠埃希菌对其敏感，通过与青霉素结合蛋白（PBPs）结合，干扰细菌细胞壁的合成起到抗菌作用。 Tris-HCl：三（羟甲基）氨基甲烷；氨丁三醇；缓血酸铵；三羟甲基氨基甲烷。在这里，Tris缓冲液主要是做核酸和蛋白质的溶剂。 EDTA：四乙酸二氨基乙烷（二氨基乙烷四乙酸），又叫托立龙、依地酸。EDTA 是一种重要的络合剂。EDTA用途很广，可用作彩色感光材料冲洗加工的漂白定影液，染色助剂，纤维处理助剂，化妆品添加剂，血液抗凝剂，稳定剂，合成橡胶聚合引发剂，EDTA是螯合剂的代表性物质。能和碱金属、稀土元素和过渡金属等形成稳定的水溶性配合物。在这里主要作用是降低细胞膜的稳定性。 TE缓冲液:TE是由Tris和EDTA配置而成的，呈弱碱性,主要用于溶解DNA，能稳定储存DNA。 RNase A：是一种被详细研究和具有广泛应用的5核酸内切酶。RNase A 对RNA有水解作用，但对DNA则不起作用。RNase A专一地催化RNA的核糖在C（胞嘧啶）和U（尿嘧啶）残基下一个核苷酸的5磷酸二酯键裂开，形成具有 2,3-环磷酸衍生物3C或3U寡聚核苷酸。如 pG-pG-pC-pA-pG 被切割产生pG-pG-pCp 和 A-pG。可以用来去除DNA制品中的污染RNA。 DNase：脱氧核糖核酸酶。是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。 二、实验原理 在含有SDS的碱性条件下，细菌细胞壁破裂，释放出来的染色体DNA、质粒DNA和蛋白质等都发生变性。当加入酸性的醋酸钾溶液将pH中和至中性时，质粒DNA为共价闭合环状结构，很快复性并溶解在溶液中。而染色体DNA由于相对分子质量大难以复性而形成缠连的网状结构。通过离心，缠结的染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去;然后用酚/氯仿抽提进一步除去少量残留的蛋白质；最后用乙醇沉淀获得质粒DNA。 三、实验器材与试剂 （一）器材 高压灭菌器，恒温摇床，高速离心机，微量可调试移液器，1.5mL离心管等。 （二）试剂 1.LB液体培养基 胰蛋白胨10 g，酵母提取物5g,NaCl 10 g,去离子水950mL。待溶质完全溶解后，用NaOH调节pH至7.0，加入去离子水至总体积1000mL，121℃，1.01×105 Pa高压蒸汽灭菌20min。 2.氨苄西林 100 mg/mL。 3.溶液一 50 mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) , 10mmol/L EDTA (pH 8.0)。 4.溶液二 （新鲜配制） 0.2mol/L NaOH , 1％ SDS。 5.溶液三 0.5mol/L醋酸钾60 mL , 冰醋酸11.5 mL ，H2O 28.5 mL。 6.酚/氯仿 将酚和氯仿等体积混合，用Tris-HCl平衡至pH 7.6 ， 置于棕色瓶中4℃保存。 7.TE缓冲液（pH 8.0) 10mol/L Tris-HCl (pH 8.0) , 1mmol/L EDTA 8.RNase A (10 mg/mL)。 9.70%乙醇、无水乙醇。 四、实验操作 1.细菌培养 将含有pQE30质粒的大肠埃希菌TG1 10 μL 接种到10 mL含氨苄西林（100 μ g/mL)的LB培养液中，37℃振摇过夜。 2.收集细菌 取1.5 ml菌液转入离心管中，10000