淋巴细胞分离与E玫瑰花环形成实验剖析.ppt

淋巴细胞分离实验E玫瑰花环形成实验 实验目的 熟悉淋巴细胞和外周血单个核细胞（PBMC）的分离原理和方法 学习E花环试验的操作方法 观察显微镜下E花环的形态 实验原理 淋巴细胞便于在体外对机体免疫细胞进行鉴定、计数或功能测定；还可以用于E花环试验、淋巴细胞转化试验及淋巴细胞培养（需无菌操作）。 淋巴细胞的方便来源是外周血，分离的原则是收率较高，纯度较好，失活较低。无论采用哪种方法，应最大可能保持细胞应有活性。 实验原理 人外周血单个核细胞（PBMC） 包括淋巴细胞和单核细胞。 单个核细胞的体积、形态和比重与外周血其他细胞不同。因此利用一种介于1.075-1.090之间的聚蔗糖-泛影葡胺（Ficoll-Hypaque）分离液作密度梯度离心，离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布,从而分离出PBMC。 人血液中各种细胞的密度如下： 红细胞：1.093 白细胞：1.092 淋巴细胞和单核细胞：1.075-1.090 血小板：1.030-1.035 F/H= 1.077±0.001 肝素抗凝全血+等量Hanks液 将F/H管稍倾斜 将稀释血液在距分层液界面上1 cm处沿试管壁缓慢加至分层液上面。 应注意保持两界面清晰，勿使血液混入分层液内。 Ficoll/Hypaque (2:1) 1500rpm, 20 min 水平离心 血小板 用毛细吸管轻轻插入灰白色层，沿管壁轻轻吸出该层的单个核细胞，盛入另一支离心管中。 将所得到的PBMC悬液用5倍体积的Hanks液或RPMI-l640洗涤2次，1500 rpm 5min。 实验原理 本实验采用的是密度梯度离心法。该方法是根据各类血细胞比重的差异（外周血中各种细胞的密度不同，人红细胞密度为1.093，粒细胞为1.092，淋巴细胞为1.074±0.001），利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心，使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立带，从而达到分离的目的。 实验原理 人 T淋巴细胞表面的CD2分子即绵羊红细胞受体（ER），在一定的实验条件下，可与绵羊红细胞（SRBC）结合，形成玫瑰花结，称为E玫瑰花环试验。 该试验常用于临床检测人外周血T淋巴细胞的数量和比例，由此可间接反映机体的细胞免疫功能状况。 实验原理 T细胞 SRBC E受体（CD2) SRBC受体 实验器材 注射器、刻度吸管、毛细吸管、玻片、试管、离心管 肝素、无Ca、Mg的Hanks液、淋巴细胞分离液、双蒸水、生理盐水、 0.8%戊二醛、瑞氏染液 家兔红细胞悬液 、豚鼠淋巴细胞、灭活小牛血清 离心机、水浴箱、显微镜等。 实验方案 取豚鼠外周血 家兔红细胞 淋巴细胞 分离 显微镜下观察 + 实验步骤 淋巴细胞的分离 用Hank’s液配成106细胞/0.1ml 加等量灭活小牛血清(0.1ml) 取0.1ml 加入1％绵羊红细胞0.1ml 混匀，37℃温箱放置5分钟 1000rpm离心5min 加1小滴瑞士染色剂，轻轻混匀 取1滴于玻片上，加上盖玻片 高倍镜下观察玫瑰花环形成细胞 置4℃冰箱 5min 30-45min 结果判断 凡能结合三个以上绵羊红细胞者为玫瑰花形成阳性细胞。 正常人的花环形成率50-70%，大致可以代表周围血中T细胞的百分数。 左:（甲紫染色，800×）：可见2个被绵羊红细胞包围而形成玫瑰环的T淋巴细胞； 右:（吖啶橙染色）：图中可见3个染成橙黄色荧光的T淋巴细胞被绵羊红细胞所包围。 T淋巴细胞玫瑰花环 T淋巴细胞玫瑰花环扫描电镜，6500× 实验步骤 1.取1ml豚鼠肝素抗凝血于试管中，加等量Hanks液稀释，手动轻轻摇匀； 2.取2ml淋巴细胞分离液加入15 ml离心管中； 3.用毛细吸管吸取抗凝血，将抗凝血全部沿管壁缓慢加入，注意保持两种液体界面清晰 4.室温下立即置水平式离心机以2000rpm 离心20分钟，离心后分为4层。 5.用毛细吸管仔细吸取血浆与分层液界面处单个核细胞（PBMC）层至一刻度离心管内。 6.加入5倍以上体积的Hanks液洗涤3次，每次以2000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀主要为单个核细胞） 。 实验步骤 5.取一定量的兔血于离心管中，用无Ca、Mg的Hanks液洗涤3次，每次离心1500 rpm5min。将压积RBC配制成1%红细胞悬液。 6.取0.1ml淋巴细胞悬液，加入等量1％RBC悬液和0.1ml小牛血清混匀，37℃水浴15min， 500rpm离心5min，取出.（直接取样，滴加事先滴有美兰染液的载玻片上，计数早期RE花环） 7.置于4℃冰箱20min，小心吸去上清，沿管壁加1－2滴0.8%戊二醛，轻轻转动试管小心混匀。 8.置于4℃冰箱15min，取出涂片，待自然干燥后，瑞氏染色，镜下观察。