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淋巴细胞分离实验E玫瑰花环形成实验 实验目的 熟悉淋巴细胞和外周血单个核细胞(PBMC)的分离原理和方法 学习E花环试验的操作方法 观察显微镜下E花环的形态 实验原理 淋巴细胞便于在体外对机体免疫细胞进行鉴定、计数或功能测定;还可以用于E花环试验、淋巴细胞转化试验及淋巴细胞培养(需无菌操作)。 淋巴细胞的方便来源是外周血,分离的原则是收率较高,纯度较好,失活较低。无论采用哪种方法,应最大可能保持细胞应有活性。 实验原理 人外周血单个核细胞(PBMC) 包括淋巴细胞和单核细胞。 单个核细胞的体积、形态和比重与外周血其他细胞不同。因此利用一种介于1.075-1.090之间的聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离液作密度梯度离心,离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布,从而分离出PBMC。 人血液中各种细胞的密度如下: 红细胞:1.093 白细胞:1.092 淋巴细胞和单核细胞:1.075-1.090 血小板:1.030-1.035 F/H= 1.077±0.001 肝素抗凝全血+等量Hanks液 将F/H管稍倾斜 将稀释血液在距分层液界面上1 cm处沿试管壁缓慢加至分层液上面。 应注意保持两界面清晰,勿使血液混入分层液内。 Ficoll/Hypaque (2:1) 1500rpm, 20 min 水平离心 血小板 用毛细吸管轻轻插入灰白色层,沿管壁轻轻吸出该层的单个核细胞,盛入另一支离心管中。 将所得到的PBMC悬液用5倍体积的Hanks液或RPMI-l640洗涤2次,1500 rpm 5min。 实验原理 本实验采用的是密度梯度离心法。该方法是根据各类血细胞比重的差异(外周血中各种细胞的密度不同,人红细胞密度为1.093,粒细胞为1.092,淋巴细胞为1.074±0.001),利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心,使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立带,从而达到分离的目的。 实验原理 人 T淋巴细胞表面的CD2分子即绵羊红细胞受体(ER),在一定的实验条件下,可与绵羊红细胞(SRBC)结合,形成玫瑰花结,称为E玫瑰花环试验。 该试验常用于临床检测人外周血T淋巴细胞的数量和比例,由此可间接反映机体的细胞免疫功能状况。 实验原理 T细胞 SRBC E受体(CD2) SRBC受体 实验器材 注射器、刻度吸管、毛细吸管、玻片、试管、离心管 肝素、无Ca、Mg的Hanks液、淋巴细胞分离液、双蒸水、生理盐水、 0.8%戊二醛、瑞氏染液 家兔红细胞悬液 、豚鼠淋巴细胞、灭活小牛血清 离心机、水浴箱、显微镜等。 实验方案 取豚鼠外周血 家兔红细胞 淋巴细胞 分离 显微镜下观察 + 实验步骤 淋巴细胞的分离 用Hank’s液配成106细胞/0.1ml 加等量灭活小牛血清(0.1ml) 取0.1ml 加入1%绵羊红细胞0.1ml 混匀,37℃温箱放置5分钟 1000rpm离心5min 加1小滴瑞士染色剂,轻轻混匀 取1滴于玻片上,加上盖玻片 高倍镜下观察玫瑰花环形成细胞 置4℃冰箱 5min 30-45min 结果判断 凡能结合三个以上绵羊红细胞者为玫瑰花形成阳性细胞。 正常人的花环形成率50-70%,大致可以代表周围血中T细胞的百分数。 左:(甲紫染色,800×):可见2个被绵羊红细胞包围而形成玫瑰环的T淋巴细胞; 右:(吖啶橙染色):图中可见3个染成橙黄色荧光的T淋巴细胞被绵羊红细胞所包围。 T淋巴细胞玫瑰花环 T淋巴细胞玫瑰花环扫描电镜,6500× 实验步骤 1.取1ml豚鼠肝素抗凝血于试管中,加等量Hanks液稀释,手动轻轻摇匀; 2.取2ml淋巴细胞分离液加入15 ml离心管中; 3.用毛细吸管吸取抗凝血,将抗凝血全部沿管壁缓慢加入,注意保持两种液体界面清晰 4.室温下立即置水平式离心机以2000rpm 离心20分钟,离心后分为4层。 5.用毛细吸管仔细吸取血浆与分层液界面处单个核细胞(PBMC)层至一刻度离心管内。 6.加入5倍以上体积的Hanks液洗涤3次,每次以2000rpm离心10分钟,弃上清,沉淀主要为单个核细胞) 。 实验步骤 5.取一定量的兔血于离心管中,用无Ca、Mg的Hanks液洗涤3次,每次离心1500 rpm5min。将压积RBC配制成1%红细胞悬液。 6.取0.1ml淋巴细胞悬液,加入等量1%RBC悬液和0.1ml小牛血清混匀,37℃水浴15min, 500rpm离心5min,取出.(直接取样,滴加事先滴有美兰染液的载玻片上,计数早期RE花环) 7.置于4℃冰箱20min,小心吸去上清,沿管壁加1-2滴0.8%戊二醛,轻轻转动试管小心混匀。 8.置于4℃冰箱15min,取出涂片,待自然干燥后,瑞氏染色,镜下观察。
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