DNA提取和制备摘要.ppt

第一部分 DNA提取总论 一、提取DNA总的原则： 1 保证核酸一级结构的完整性； 2 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子的污染应降低到最低程度； 3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； 4 其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。 二、样本来源： 理论上所有有核真核细胞、细菌、病毒都可以提取DNA 样本选择取决于试验目的 全血是基因组提取最常见的样本 血清、血浆、外周血有核细胞、痰液、体液、棉拭子采集的各种分泌物、组织（包括骨髓）和羊水等都是分子诊断的检验材料，其中全血、血浆（血清）标本占分子诊断的60%以上 DNA提取前样本采集、预处理和保存： （一）全血 1.抗凝剂 EDTA-Na2 或枸橼酸钠 作为抗凝剂 不宜使用肝素 （二）血浆和血清 血浆和血清是检测释放入血的游离核酸最主要的标本来源，用来检测病毒、细菌，以及肿瘤细胞等等释放出来的游离核酸和蛋白质产物，在临床上被广泛应用于病原微生物和肿瘤标志基因的检测. 三、DNA的收率 四、DNA提取的基本步骤 1、核酸的释放： 破裂细胞 释放核酸（机械法与非机械法） 2、核酸的分离与纯化 3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤 4、DNA鉴定：浓度鉴定 纯度鉴定 完整性鉴定 五、DNA提取试验中常遇到的问题 基因组DNA收率较低或无基因组DNA 样本材料太少 细胞破裂不够充分，DNA释放不完全 离心力偏小 两相分离不完全… … DNA降解的原因 样本不够新鲜，采集材料过陈旧 样本本身存在大量DNA酶 提取DNA的生物活性差的原因？ 提取的基因组DNA盐浓度过高 基因组DNA中乙醇未清除净 基因组DNA中可能存在其他抑制因素 提取基因组DNA，有时加入蔗糖的原因 加入多糖，保护DNA长度 不可忽视的细节  —血液基因组提取 浓度：100－300ng/ul 纯度：任何杂质都可能导致DNA在储存过程中的降解，因此要确保纯化得到的核酸的纯度。 温度：纯化得到基因组DNA之后需将DNA溶液分装保存到-20℃，反复冻溶会导致DNA的降解。 溶解DNA Buffer：纯化得到的基因组DNA最好溶解在TB Buffer (TIANGEN) 或者Tris缓冲液里，因为大片段的基因组DNA在酸性水溶液中不稳定，易水解。 纯度（ OD260-320 /OD280-320 ） 紫外分光光度计进行测量（选择正确的稀释倍数，确保OD260 值在0.1~1.0之间，通常离心柱法稀释4－5倍；溶液裂解法稀释20－30倍）OD260-320 /OD280-320 1.7 说明有蛋白的污染OD260-320 /OD280-320＝1.7～1.9 说明纯度很好OD260-320 /OD280-320 1.9 说明有部分降解或有RNA污染 得率 紫外分光光度计进行测量Yield＝ OD260×50ng/ul×稀释倍数 电泳检测要控制上样量。上样量过大会导致泳道过亮、拖尾等现象，影响正确判断。 如果加样孔里有亮带，说明有蛋白污染。 若上样量合适，泳道有弥散、拖尾现象，说明书基因组DNA有降解。 TIANamp微量样本基因组DNA提取试剂盒样本来源一致，分别取1μl，10μl，50μl，100μl为起始样本提取基因组 。各取2μl基因组DNA为模板，扩增GAPDH基因，荧光定量PCR分析实验结果。 DNA检测方法－荧光定量PCR检测 微量样本基因组DNA的检测通常采用荧光定量PCR检测，例如：干血点、微量血液等。 试剂选择指南 硅胶膜吸附法 微量样本（DP316） 口拭子（DP322） 0.2-1ml血液(DP318) 应用：1. HLA分型、亲子鉴定及芯片检测实验：对DNA的纯度、浓度均有要求。2. 口拭子等特殊样本的提取 适合样本：全血、白膜层、血细胞、血凝块、白细胞、口拭子、干血点、羊水、血清/血浆、漱口水、微量组织等 溶液法(DP319) 应用：下游实验所需DNA量较大，例如SNP 适合样本：全血、白膜层、血细胞、血凝块、白细胞等 磁珠法(DP327) 应用：微量样本DNA提取，可配合工作站使用。 适合样本：微量血液、干血点、微量组织 * * * 第十天提取效果差 第四天收率90% 提取效果差 室温 第十天收率85% 第10天提取效果差 第四天收率90% 4 ℃ 保存2个月，第10天收率90%