第二章沉淀法综述.pptVIP

用有机溶剂沉淀蛋白质，需加入的有机溶剂量，一般以体积为单位计算： V＝需加入有机溶剂的体积 V0＝蛋白溶液的原始体积 S1＝蛋白溶液中有机溶剂的浓度(体积百分浓度) S2＝蛋白溶液中欲达到的溶剂浓度(体积百分浓度) 如果使用的有机溶剂含量不是100％而是95%，则公式中的100应改95，余此类推。 需要指出： （1）低温下操作 由于有机溶剂加入水溶液时产生放热反应会引起蛋白质变性 有机溶剂预冷至-10℃，在低温下进行 第二章 沉淀法 沉淀法（溶解度法）—是纯化生物大分子物质常用的一种经典方法优点：操作简单，成本低廉分类：盐析沉淀 有机溶剂沉淀 选择性沉淀 第一节 基本原理 原理： 根据各种物质的结构差异性（如蛋白质分子表面疏水性基团和亲水基团之间的差异性）来改变溶液的某些性质（如pH、极性、离子强度、金属离子等），进而导致有效成分的溶解度发生变化。  一、盐析法 原理：是蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升（盐溶），但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出（盐析）。 原因：盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出。 第二节 沉淀的类型与操作 一般操作步骤（蛋白质分级沉淀时常用） 1）选择一定浓度范围的盐溶液（如0-25％饱和度硫酸铵），使部分杂质呈“盐析”（沉淀）状态，有效成分呈“盐溶”（溶解）状态。 2) 经离心后得到上清液，再选择一定浓度范围的盐溶液（如25％-60％饱和度的盐溶液），使有效成分等物质呈盐析状态，而另一部分杂质呈盐溶状态，用离心法收集的沉淀物即为初步纯化的有效成分物质。 1. 盐的分级沉淀 （1）盐类的选择  常选用：硫酸铵优点：a. 溶解度大，对温度不敏感，当水温25℃时，硫酸铵的饱和溶解度（即每升溶剂可溶解盐的克数）为769克。当水的温为0℃时，其饱和溶解度679克。 b. 分级效果好，有些抽提液经过加入适量硫酸铵的一次性可除杂蛋白75%以上 c. 有稳定蛋白质结构的作用，将2-3mol/L硫酸铵盐析的蛋白质置低温下保存一年，其性质没有变化 d. 价格低廉，废液可肥田缺点：即得到的样品欲继续纯化时，需花一定时间脱盐 （2）硫酸铵盐析的操作 ① 固体加入法：在溶液中逐步加入固体硫酸铵，加到一定饱和度时，蛋白质可沉淀出来。注意：控制加入的速度，在搅拌下、以少量多次方式缓慢地加入，待先加的硫酸铵溶解后再加入少量的硫酸铵。 ② 饱和溶液加入法 是使蛋白质脱水沉淀比较温和的方法 蛋白质溶液中逐步加入预先调好pH的饱和硫酸铵溶液，不同饱和度所需的硫酸铵量可用计算： V＝需加入硫酸铵溶液的体积（毫升）；V0＝原来溶剂的体积（毫升）；S1＝原来溶液的百分饱和度；S2＝要求达到的百分饱和度；S3＝需要加入硫酸铵溶液的饱和度（一般用100%的）。 优点：比加入固体硫酸铵沉淀法温和。 缺点：对于大体积样品不适用。因为硫酸铵溶液的大量加入，将导致样品溶液体积增加。 ③ 透析盐析法 将盛蛋白质溶液的透析袋放入一定浓度的大体积盐溶液中，通过透析作用来改变蛋白质溶液中的盐浓度。特点：盐浓度是以连续的状态变化，可以避免盐浓度局部升高产生的不良影响，分离效果好。缺点：只用于要求较精确、样品体积小的试验。 2．盐析曲线的制作 用盐析法沉淀欲分离样品时所需盐浓度范围要通过实验确定。 具体步骤： 取一定体积已测含量的蛋白质或酶待分离溶液，调节pH至稳定范围，分6-10次加入不同量的硫酸铵：第一次加硫酸铵到溶液出现微弱混浊状态时，静置一段时间，离心或过滤即得到第一个分级沉淀部分。接着以同样的操作加硫酸铵到上清液或过滤液中，则得到第二个分级沉淀部分。 如此连续进行，便可得到6-10个分级沉淀部分。然后将每个分级沉淀部分分别重新溶解于一定体积的适宜pH的缓冲液中，根据其蛋白质或酶含量和相对应的硫酸铵浓度之间的关系作图，即可得到典型盐析曲线。 在此曲线基础上，参照分级试验方法，可找出有利于提高收得率和纯化倍数的精细盐析范围。 3. 盐析的影响因子 （1）盐析常数（Ka） 蛋白质在溶液中的溶解度和该溶液的盐浓度的关系为：溶解度（S，以mg/ml表示）的对数值与溶液中盐的浓度（M）成反比例关系，可用公式表示： lgS＝β-Ka· M 式中β表示有效成分在水中溶解度的对数值；M表示克分子浓度； Ka表示有效成分在特定条件下的数值，即表示有效成分的溶解度降低的速率是随着盐浓度的增加而增加的。 Ka值大，则意味着有效成分溶