分子生物学基本操作分析报告.pptVIP

分子生物学基本操作 手套 原则上不论什么实验都应带手套操作 特别是 无菌操作； 与RNA有关的所有操作； 重要克隆菌的挑单克隆，扩增，保存等 与有毒试剂有关的所有操作，比如染胶时的EB；提取用的有机试剂（通风橱）； Pipett 枪头 加样-使用合适的枪与枪头 比如加含有甘油的试剂，酶等最好用clear Tips 它不会有残留； 如果甘油含量高，或特别浓稠的试剂最好用Clear, Non-Beveled Tips（或将一般枪头去尖头）； 与RNA操作有关的枪头最好为Sterilized Micro-filter Tips，或者至少为用DEPC水处理的枪头； 加样体积应为枪头最大体积的20%-100%，低于该范围的用小一号的枪头；大于该范围的可以用同样的枪头加样两次（两次体积相当，比如加210ml, 可以用200ml枪头以105ml加两次）； 加样 加用任何试剂前要将试剂混合（除饱和酚，或一些特别的有机试剂） 加样的枪头应在试剂的中间表层吸收，防止枪头外壁带用过多试剂，改变加样实际体积（除饱和酚外，一定要伸到tris饱和液下的酚中） 加样酶（冰上）时，应注意体积准确，及外壁不带，内壁吹打干净，注意用枪头从反应体系的管底吸上，反复吹打 多通道枪 混匀----所有试剂在使用前都要充分混匀; 多数分子操作在加样后、反应前都要充分混匀 水浴 提前10-30分钟调好温度;稳定后才能使用; 水位不可以低于水浴锅高度的50% 用合适浮子; 定时; 使用后需要添水或换水 关闭电源 离心 离心前，如果需要预冷，至少预冷15分钟。盖好管盖，充分混匀； 质量对称放置； 不合适的离心管应外套其他型号的管子；如离心0.2管，最好是放在0.5管套1.5管中；如短暂离心可以放在1.5管中； 盖上离心机的内盖 离心后，如果要移动，放在试管架上移动，防止破坏液面； 短暂离心要在3000-8000rpm范围内；时间应短于30秒； 如果离心机被有机试剂或其它样品污染当事人应及时清理 细菌DNA的提取 环状双链DNA、不与组蛋白结合（古菌具有组蛋白类蛋白）、基因总数水平一般为103-104，一般情况下，一个细胞中只有一条染色体或一套基因组。 DNA的提取过程就是用化学和物理的方法，使DNA与其他细胞物质分离开来的过程。 一般本实验室采用的有高盐法，CTAB法，煮沸法。 本次实验采用SDS高盐沉淀法。 菌株划LB平板活化，挑单菌落，接3ml 试管，于30℃剧烈振荡培养过夜至稳定期。离心收集菌体1ml，然后用等体积TEN洗涤菌体，离心收集菌体，悬浮于等体积TEN中。 加入200ul溶菌酶（100mg/ml），37℃水浴1h，再加入300ul 20%的SDS，37℃水浴至溶液澄清。** 加入1/3体积饱和NaCl剧烈振荡，12000 rpm离心10min。我们的实验中上清就取1ml,以方便后续实验。 上清用等体积酚抽提1次， 12000 rpm离心10min，小心地吸取上清。 上清再用等体积的酚：氯仿抽提1次， 12000 rpm离心10min，收集上清。 上清再用等体积的氯仿抽提1次，收集上清。 上清中加入等体积TE（稀释调整NaCl浓度），0.6倍体积异丙醇沉淀，12000 rpm离心10min，70%乙醇洗涤沉淀，乙醇挥发后溶于100ul TER中，取1ul电泳检测，其余的-20℃保存备用。 琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像实验步骤 1、具体步骤 ?1 打开凝胶成像仪电源（机器后部），开电脑； ?2 将染色后凝胶用水冲洗后，将凝胶放在透射板正中， 并关严暗仓门，打开紫外灯； ?3 打开Quantity one软件，点击basic，File中选择 Get Doc EQ…，调节使图象到达合适亮度、大小及清晰度； ?4 待图象最优化时，成像freeze在屏幕上，关闭紫外灯， 点击“Save”保存； ?5 关闭软件； ?6 打开暗仓门，拉出透射台，凝胶丢弃至专门垃圾桶， 插掉透射板上水迹； ?7 关上暗仓门。 2、Quantity One 软件 是The Discovery Series 软件家族的成员，它是一 个功能强大的灵活软件包，可成像和分析一维电泳凝胶、斑点印迹、狭线 印迹和菌落计数。 Quantity One 软件能定量和分析多种数据，包括从光密 度仪、储能磷屏成像仪、荧光成像仪和凝胶成像系统采集的放射性、化学 发光、荧光和染色等样品。Quantity One提供自动分析功能以快速获取高 质量结果。 3、注意事项 ?1 开关仓门时防止将EB沾在仓门盖上; 2 透射板紫外灯寿命有限，调整图象后及时成像； ?3 凝胶应及时清理，防止凝胶固化后贴附在透射板上，造成成像不清晰； 4 成像结束后插掉透射板上水迹，防止仪器内部生锈引起