2004-2007年河北省规模猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异的分析.docVIP

其他０  ８８７  Ｔ０６００５８ ２００４－２００７年河北省规模猪场 猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）变异分析  韩庆安１’２许玉静１  胡自然１  吴秀楼１  刘  红１郑  丽１ 李志民１李同山１杨汉春２ （１．河北省动物疫病预防控制中心河北保定０７１０００；２．中国农业大学动物医学院北京１０００９４） 摘要：为了了解河北省规模猪场ＰＲＲＳＶ的变异情况，采用ＲＴ－ＰＣＲ方法对２００４－２００７年采集的１２个典型发病场的 病料样本进行ＰＲＲＳＶ Ｎｓｐ２和ＯＲＦ５基因扩增、克隆和测序，利用ＤＮＡｓｔａｒ和ＤＮＡＭＡＮ软件分析所测序列。结果表明，扩 增的０ＲＦ５基因氨基酸序列同源性为９８．７％一１ ００％，与美洲型和欧洲型ＰＲＲＳＶ参考株的同派Ｉ生分别为８８．９％～１ ｏｏ％和 ６２．９％～６３．５％；扩增的Ｎｓｐ２基因氧基酸序列同源性为８２．８％一１ ００％，与参考毒株的同源性为７６．５％一１ ００％，从２００６－２００７ 年样本中扩增的６个Ｎｓｐ２基因均在第４８１位和５３３—５６１缺失３０个氨基酸．系统进化树分析表明，它们均属于美洲型， 分属于２个基因亚群，其中ＨＢ０５０３与ＢＪ４、ＮＪｌ、ＨＮＩ，ＬＰｌ和ＶＲ－２ ３３２遗传关系较近，其它的与ＪＸＡｌ、ＳＸ和ＢＪ株遗传 关系较近。表明，危害河北省规模猪场的ＰＲＲＳＶ已经发生了较大的变异，其中２００４－２００５年的属低致病性ＰＲＲＳＶ毒株， 而２００６－２００７年的属高致病性ＰＲＲＳＶ毒株。 关健词：ＰＲＲＳＶ；Ｎｓｐ２；ＯＲＦＳ；变异分析  猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ，ＰＲＲＳＶ）引起的以母猪发热、流产，断奶前、后的仔猪死亡率升高，不同年龄猪呼吸障碍等为 临床特征的疾病【ｌ刁】，是猪呼吸道疾病综合征（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｃｏｍｐｌｅｘ，ＰＲＤＣ）的主要病原之一。１９９１ 年，荷兰学者Ｔｅｒｐｓｔｒａ等人在感染猪体内分离到欧洲型ＰＲＲＳＶ，命名为Ｌｅｌｙｓｔａｄ病毒（ＬＶ）【ｌ＇４】；同年， 美国学者Ｂｅｎｆｉｅｌｄ等人分离到美洲型ＰＲＲＳＶ，命名为ＹＲ．２３３２口ｌ。近年来，我国学者相继分离鉴定了 美洲型ＰＲＲＳＶ的ＣＨ．１ａ、Ｓ１、ＨＢ—ｌ和ＨＢ一２等毒株。ＰＲＲＳＶ为单股正链ＲＮＡ病毒，包含８个开放阅 读框（ＯＲＦｓ），其中ＯＲＦｌ编码有关ＲＮＡ复制和转录的蛋白，Ｎｓｐ２属非结构蛋白，位于ＯＲＦｌ区，可 能与ＰＲＲＳＶ的嗜细胞性和嗜组织性有关肛８｜。ＯＲＦ５编码的糖蛋白ＧＰ５是主要的保护性抗原，可以诱导 细胞凋亡和参与ＰＲＲＳＶ粒子与受体的结合ｉ９。ｌ】；ＰＲＲＳＶ的变异分布于整个基因组，但以Ｎｓｐ２基因和 ＯＲＦ５基因变异最大。ＰＲＲＳＶ美国分离株ＭＮｌ８４和我国分离株ＨＢ一２，其ＮＳＰ２均缺失数量不等的氨 基酬也９】；不同的ＰＲＲＳＶ分离株，其ＧＰ５氨基酸序列存在数量不等的点突变［６，１２－１４】，国内外学者多以 ＯＲＦ５基因绘制ＰＲＲＳＶ的系统发育树［１５－１７］。自２００６年以来，在江西、江苏、安徽、浙江等省的部分猪 场相继发生了以“持续高热”为主要特征的急性传染病，其显著特点是高发病率和高死亡率，仔猪发病 率可达１００％，死亡率可达５０％以上，母猪流产率可达３０％以上，也可致育肥猪发病死亡。研究表明， 我国南方多数省份出现的“猪高热病”疫情均是以ＰＲＲＳＶ变异株为主，包括其它病毒性病原体和细菌 等多种病原体混合感染造成的。截至２００７年７月份，我国农业部通报全国已有２６个省、市发生了高致 病性猪生殖与呼吸综合征，疫点３０９个，防控形势相当严峻。该疫情在全国范围内广泛流行，导致生猪 大批死亡和淘汰，给养猪生产造成了严重损失ｕ引。自２００４年以来，ＰＲＲＳＶ对河北省规模猪场的危害也 在逐年加大。本研究利用分子生物学技术解析２００４，２００７年河北省ＰＲＲＳＶ阳性样品中Ｎｓｐ２和ＯＲＦ５ ８８８蟋》２００９年学术年会 基因的变异情况，分析ＰＲＲＳＶ遗传变化趋势，为猪繁殖与呼吸综合征的综合防制提供分子流行病学信 息，为我国防制ＰＲＲＳ提供分子病毒学资料。 １材料与方法 １．１病料 病料样品（肺脏、扁桃体和脑等）来源于２００４．２００７年１２个感染ＰＲＲＳＶ严重的规模猪场。 １．２仪器和试剂 大肠杆菌ＪＭｌ０９菌株：由本实验室保存；ｐＧＥＭ．Ｔ克隆载体、ＲＮＡｇｅｎｔｓＲ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、 ｐＧＥＭ—Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ试剂盒、ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ和ＰＣＲ所用试剂：Ｐｒｏｍｅｇａ公司产品； Ｌｏｗ