2005-2008年上海临床分离肺炎支原体对抗菌药物敏感性的分析、大环内酯类抗生素耐药机制的研究及临床疗效的分析.docVIP

１２２  参评青年优秀论文  ２００５—２００８年上海临床分离肺炎支原体对抗菌药物的敏感性分析、 大环内酯类抗生素耐药机制研究及临床疗效分析  刘  杨１，  张  泓２，  叶信予１，  徐晓刚１，  李万华１，  朱德妹１，  王明贵１ １．复旦大学附属华山医院抗生素研究所，上海２０００４０；２．上海交通大学附属上海市儿童医 院，上海２０００４０  摘要：目的  了解目前上海临床分离肺炎支原体对常用抗菌药的敏感性，明确对红霉素耐药株的耐药机制，评价肺炎支 原体感染临床疗效。方法从鼻咽部吸取液中直接分离肺炎支原体。采用微量稀释法测定１０株肺炎支原体对大环内酯类、 四环素类和氟喹诺酮类药物敏感性。对肺炎支原体核糖体２３Ｓ ｒＲＮＡ全序列进行扩增及测序。采用限制性片段长度多态性 分析（ＰＣＲ—ＲＦＩ。Ｐ）对肺炎支原体进行分型。采用非参数分析方法研究影响肺炎支原体感染治疗预后的因素。结果 四环素 类及氟喹诺酮类对肺炎支原体具有良好活性。肺炎支原体临床分离株对红霉素敏感性低，ＭＩＣ，。和ＭＩＧ。均＞１２８ ｍｇ／Ｌ。 ８１．４％（８３／１０２）临床株对红霉素耐药（ＭＩＣ均＞１２８ ｍｇ／Ｌ）。红霉素耐药肺炎支原体均存在Ａ２０６３Ｇ的核苷酸点突变。 ８５．３％（８７／１０２）临床分离株属于ＲＦＩ。Ｐ １型。红霉素耐药肺炎支原体感染应用阿奇霉素治疗后退热时间较敏感株延长。结 论上海分离肺炎支原体对红霉素耐药率高，核糖体２３Ｓ ｒＲＮＡ的Ａ２０６３Ｇ核苷酸点突变是导致耐药的原因。红霉素耐药株 感染可使呼吸道感染患儿病程延长。 关键词：肺炎支原体； 大环内酯类； 四环素类； 氟喹诺酮类； 耐药性  肺炎支原体（蛳ｃｏ户Ｚ口ｓｍｎ户竹Ｐ“ｍｏ行ｉｎｅ）是引起社区获得性呼吸道感染的重要病原体之一，尤其在学龄 期儿童和青少年中此病原体感染常见。大环内酯类抗生素如红霉素、阿奇霉素和克拉霉素是治疗肺炎支原 体感染的最常用药物。近年来，红霉素耐药肺炎支原体在全球范围内报道增多，而红霉素耐药肺炎支原体感 染患儿的临床疗效研究报道很少。本研究对２００５—２００８年在上海临床分离的肺炎支原体株进行药物敏感 性测定，以明确目前肺炎支原体对常用抗菌药物的敏感性，并对红霉素耐药肺炎支原体的耐药机制以及其感 染患儿的临床治疗疗效进行了研究，现将结果报道如下。 材料和方法 一、菌株的分离培养 痰液标本来自２（）０５—２００８年期间上海市儿童医院呼吸道感染患儿因诊断需要常规留取的鼻咽部吸取物。 根据文献方法进行肺炎支原体分离培养。临床标本直接接种于肺炎支原体液体分离培养基，３７孵育至清澈 变色阳性者转种至肺炎支原体ＰＰＬ（）固体培养基，５％Ｃ（）２ ３７培养后显微镜下挑取纯化菌落再次接种于ＳＰ４ 液体培养基，变色后至液氮保存。根据文献针对肺炎支原体Ｐ１黏附蛋白合成ＰＣＲ引物进行扩增用，以鉴定所 有临床分离肺炎支原体株。肺炎支原体标准株ＭＰＦＨ（ＡＴＣＣ １５５３１）由北京儿科研究所提供。 二、药物及液体培养基 药物敏感性测定所用药物均为标准品。红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、交沙霉素、四环素、多西环素、环丙 沙星和左氧氟沙星为中国药品生物制品检定所标准品，米诺环素为Ｓｉｇｍａ公司标准品，莫西沙星为Ａｍｅｒｉ— ｃａｎ Ｃｕｓｔｏｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．标准品。肺炎支原体液体分离培养基（其昌达公司）用于原代分离，ＰＰＩ，０培养 基（ＢＤ公司）用于菌种转种和分离，ＳＰ４液体培养基（Ｒｅｍｅｌ公司）用于菌种保存及药敏试验。 三、ＭＩＣ测定 按文献方法以微量稀释法测定肺炎支原体对大环内酯类、四环素类和氟喹诺酮类药物中１０种抗菌药的 药物敏感性。肺炎支原体标准株ＭＰＦＨ（ＡＴＣＣｌ５５３１）为质控菌株。 四、肺炎支原体核糖体２３Ｓ ｒＲＮＡ基因序列分析 采用煮沸法提取模板。自行设计引物（５，－ＣＡＡＴＡＡＧＴＴＡＣＴＡＡＧＧＧＣＴＴＡＴＧＧＴＧＧＡＴＧＣ一３’和 参评青年优秀论文 ５’一ＴＣＣＡＡＴＡＡＧＴＣＣＴＣＧＡＧＣＡＡＴＴＡＧＴＡＴＴＡＣＴＣＡＧ一３’）采用ＰＣＲ法扩增对肺炎支原体２３Ｓ  １２３ ｒＲＮＡ 全序列。反应体系５０ ｐＬ，ｄｄＨ：０ ３３．７５ ｐＬ，１０×ＬＡ ＰＣＲ缓冲液５弘Ｌ，ｄＮＴＰ ８ ｐＬ，正向及反向引物各１ 弘Ｌ，ＴａＫａＲａ ＬＡ酶０．５弘Ｌ，模板５肛Ｌ。ＰＣＲ循环条件为：９４１０ ｍｉｎ，９４３０ ｓ，６１３０ ｓ ７２４ ｍｉｎ， ７２１０ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｍｉｎ。产物由华大基因科技有限公司进行测序。采用ＤＮＡｓｔａｒ软件与肺炎支原体Ｍ１２９（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．Ｘ６８４２２）进行序列比对分析。 五、限制性片段长度多态性分析（ＰＣＲ—ＲＦＩ