蛋白芯片联合检测多种抗结核抗体.pptVIP

论文分析 结核病 最具威胁性的感染性疾病之一 全球 每年新发900万例 每年死亡数约为300万 我国 每年新发145万例 每年死亡数约为25万 肺结核病诊断金标准： 痰涂片找到抗酸杆菌 ——灵敏度低、特异性差、漏诊漏治时有发生 阳性 确诊肺结核； 阴性 不能保证没有患肺结核 （痰涂片检查是手工操作为主，具有一定的局限性：痰标本的好坏，涂片取样问题，染色剂的问题，均可导致痰涂片检查结果不准。） PPD法（结核菌素实验）——并不用于临床检测 结核抗体检测——商业化芯片（特异度、灵敏度低） 蛋白芯片——稳定、高通量、高度敏感 蛋白芯片：7种结核特异性抗原 样品：静脉血（分离血清） 胸水、腹水、关节液（高速离心驱除纤维蛋白原等干扰成分） 1 2 3 4 5 6 7 A Ag85A 38kD CFP10 MPT51 + + + B Ag85A 38kD CFP10 MPT51 16kD TB10.4 ESAT-6 C Ag85A 38kD CFP10 MPT51 16kD TB10.4 ESAT-6 D - - Blank Blank 16kD TB10.4 ESAT-6 +:人类IgG -：空载体表 达的蛋白 选定蛋白→细胞定位→设计引物→ →构建载体、克隆→纯化蛋白 若患者已感染结核分枝杆菌，则体内出现相应抗体，在蛋白芯片上即显示阳性。 信号检测：免疫金银染色法 （胶体金葡萄球菌A蛋白探针） 胶体金：特定大小的金颗粒，由于静电作用呈稳定胶体状态。 胶体金葡萄球菌A蛋白探针标记后：黑褐色颗粒（LM下） 大量聚集——粉红色斑点（肉眼） 加入银显影液——放大结果 特异性吸附抗体或抗原 胶体金-SPA→IgG的Fc段（样品中） 结核分枝杆菌特异性抗原（蛋白芯片上） ——胶体金葡萄球菌A蛋白探针 胶体金标记葡萄球菌A蛋白探针的制备 样品采集处理 蛋白芯片的制备 室温孵育1h、洗涤 室温孵育30min、洗涤 银显影液 避光作用10min，洗涤晾干 分析显色强度（ CanonLiDE20扫描仪） 胶体金-SPA→IgG的Fc段（样品中） 结核分枝杆菌特异性抗原（蛋白芯片上） 1 2 3 4 5 6 7 A Ag85A 38kD CFP10 MPT51 + + + B Ag85A 38kD CFP10 MPT51 16kD TB10.4 ESAT-6 C Ag85A 38kD CFP10 MPT51 16kD TB10.4 ESAT-6 D - - Blank Blank 16kD TB10.4 ESAT-6 +:人类IgG -：空载体表达的蛋白 1 2 3 4 5 6 7 A Ag85A 38kD CFP10 MPT51 + + + B Ag85A 38kD CFP10 MPT51 16kD TB10.4 ESAT-6 C Ag85A 38kD CFP10 MPT51 16kD TB10.4 ESAT-6 D - - Blank Blank 16kD TB10.4 ESAT-6 若为阴性说明该蛋白芯片不可用 若为阳性说明该蛋白芯片不可用 胶体金→SPA→IgG的Fc段（样品中） 结核分枝杆菌特异性抗原（蛋白芯片上） 1 2 3 4 5 6 7 A Ag85A 38kD CFP10 MPT51 + +