15 核酸的物理化学性质-王镜岩生物化学(全).pptVIP

第15章 核酸的物理化学性质;第一节 核酸的水解 ;核酸的水解;一、酸水解 ;二、碱水解 ;;三、酶水解 ;(3) 按磷酸二酯键断裂的方式 在3’-OH与磷酸基之间断裂 在5’-OH与磷酸基之间断裂 ; 2．核糖核酸酶类 ;(2) 核糖核酸酶T1 (3) 核糖核酸酶T2; 3．脱氧核糖核酸酶类 ;(3) 限制性内切酶 ; 在上世纪中期，以Arber等人对入噬菌体在大肠杆菌不同菌株上的平板培养效应的研究为基础，发现了原核生物体内存在着寄生控制的限制和修饰系统。;核酸内切限制酶的类型 ;切割位点 ;Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性;a. 识别位点：; ;核酸内切限制酶的命名法;第二节 核酸的酸碱性质 ;1．碱基的解离;例如：胞嘧啶的解离;例如：腺嘌呤的解离;C、A、G均具有酸性和碱性解离（得到质子、失去质子），可形成兼性离子，具有等电点。 U、T只具有酸性解离（失去质子），无兼性离子形式，不具有等电点。 ;由于磷酸基的存在，使核苷酸具有较强的酸性，发生两级解离，由于核苷酸含有磷酸基与碱基，为两性电介质，它们在不同pH的溶液中解离程度不同，在一定条件下可形成兼性离子。带负电荷的磷酸基正好与带正电荷的含氮环数目相等，这时的pH即为此核苷酸的等电点 pI = (pk1’+pK2’)/2 pK1’值是由于第一磷酸基P03H2的解离，pK2’是由于含氮环＝N+H的解离;两性电离和等电点;等电点的计算; U、T只具有酸性解离（失去质子），无兼性离子形式，也无等电点。其对应的核苷酸只能用磷酸的pk来衡量带负电荷 ;研究核苷酸解离的意义 1、了解核酸的物理化学性质 2、制备和分析核苷酸 （应用离子交换层析、和电泳等方法分离核苷酸极其衍生物）;第三节 核酸的紫外吸收 ; 嘌呤碱与嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240—290nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，最大吸收值在260nm附近。不同核苷酸有不同的吸收特性。所以可以用紫外分光光度计加以定量及定性测定。 ;1、 核酸样品纯度和含量的鉴定 ;当C=50ug／mL时： 双螺旋DNA的 A260=1.00 单链DNA(或RNA)的 A260=1.37 寡核苷酸的 A260=1.60 ;对于不纯的核酸可以用琼脂糖凝胶电泳分离出区带后，经溴化乙锭(EB)染色在紫外灯下粗略地估计其含量。 ;有时核酸溶液的紫外吸收以摩尔磷吸光系数来表示： ε(P)=A/c l ;第四节  核酸的变性、复性及杂交 ;一、核酸的变性(denaturation) ;决定双螺旋结构状态的因素;1. 引起核酸变性的因素 ;（3）低盐变性：0.01mol/l时，由于磷酸基的静电斥力，可以配对的碱基无法相互靠近。 （4）变性剂：尿素 、甲醛 ，可以打开氢键;2. 核酸变性的特点;当C=50ug／mL时： 双螺旋DNA的 A260=1.00 单链DNA(或RNA)的 A260=1.37 ;;3. 影响Tm值的因素 ;(3) 介质中的离子强度 一般说在较高的离子强度时，DNA的Tm值较高，而且熔解过程发生在一个较小的温度范围之内。;二、复性 (renaturation) ;（2）、有足够的温度以破坏无规则的链内氢键，但又不能太高，否则配对碱基之间的氢键又难以形成，一般用比Tm低20--25℃的温度。 将热变性的DNA骤然冷却时，DNA不可能复性。缓慢冷却时，可以复性退火。;（3）、DNA的性质也影响复性 DNA的片段越大，复性越慢。 DNA的浓度越大，复性越快。 重复序列越多，复性越快。 ;2、Cot 曲线 ;;三、核酸的杂交 (hybridization) ;Southern-blotting: DNA片段的转移Northern-blotting: RNA片段的转移Western-blotting: 蛋白质在PAGE后 的转移Eastern-blotting: 蛋白质在IEF后的转移;这是用于检测核酸、蛋白质等生物大分子的一项重要生化技术，其原理是利用低电压、高电流的直流电场（电转印）使电泳后的分离区带转移到特定的固相纸膜上产生印迹，然后再用各种检测方法对这些印迹进行分析鉴定，以检出所需的某一组分。;（1）、Southern印迹杂交;;（2）Northern blotting;（3）Western blotting;（4） Eastern-blotting: