第三章定点突变与重组蛋白表达.ppt

第三章 ;DNA recombinati;A specific DNA ;第一节 工具酶及载体限;根据酶结构，识别切割序列上的特;Some type II re;限制酶反应的影响因素 1.;二.连接酶和末端转移酶Two ;无标题;三. 载体（vector)质粒;分子量相对较小 具有可供选;无标题;2. 噬菌体Bacteriop;Using bacteriop;无标题;ADVANTAGES OF T;3. 黏性质粒 ;Artificial cons;The cosmid DNA ;4. 表达载体 （expres;制备目的基因 ;一. 目的基因的制备1. G;基因文库要包含所有的编码和非编;2. Genes are is;A cDNA library ;3. Specific DNA;无标题;4. Gene are syn;二. 目的基因与载体重组黏性末;无标题;三. 重组DNA导入宿主细胞T;1. 氯化钙法 特点：;四. 重组体的筛选和鉴定1. ;无标题;第三节 定点突变寡核苷酸介导;定点突变(site-direc;Oligonucleotide;site-directed m;无标题;1. 影响的各种因素一. 寡核;2. 几种寡核苷酸介导的基因突;1)将待突变的基因克隆到质粒中;Figure 1. dsDNA;2)含有U的目标 DNA 与含;Figure 2. Targe;3)最后，杂交的双链 DNA ;Figure 3. Hybri;?抗生素抗性回复突变法此体系利;? previousProme;pALTER?-1 载体含氨苄;无标题;无标题;无标题;无标题;适合的寡核甘酸片断可以同时用在;特点：多克隆位点，用以对目标基;?基于去除特定限制酶切位点的突;该该位点也不存在目标基因上;突变时用两个引物：一是突变引物;优点：不需制备单链DNA;不需;优点：方便、快捷、不受限制性内;5 Add-on mutag;(A) 5 add-on m;加到PCR引物5‘端的序列掺入;取代突变;缺失突变;插入突变;无标题;几点补充：重叠延伸反应中非生产;盒式突变（cassette m;四. 随机突变（random ;无标题;待突变基因克隆到载体上，其下游;ExoIII催化线性双链DNA;S1核酸酶处理单链末端，形成平;第四节 重组蛋白质的表达;无标题;一. 目标蛋白在E.coli中;优点 1.遗传学和生理学背景;不足 1. 不能进行典型真核;表达载体 （expressin;Recombinant pro;表达载体的一般特点 复;2. 与外源基因有效表达的相关;3. 蛋白质表达的方法A ty;Inoculation of ;For the most us;After induction;4. 改善表达水平及溶解性的方;2）如何改善外源蛋白的溶解性 ;1. Reducing the;2. Changing the;3.Co-expression;GroEL/GroES复合物G;无标题;无标题;Foldases accele;Co-expression o;4. Periplasmic ;Secretion is ac;5. Using specif;6. Addition of ;8. In vitro den;3) 如何改善蛋白质的稳定性I;1. N-end rule. ;Sometimes the l;ii.Periplasmic ;4）如何减少蛋白质的毒性Low;1. Incomplete r;constitutive ex;constitutive ex;2. Besides tigh;3.Toxicity upon;5）如何蛋白质共表达 The ;Different metho;2. Co-expressio;二. 目标蛋白在酵母细胞中的表;酿酒酵母（Saccharomy;酵母表达系统的缺陷和解决方法翻;有关酵母表达载体的复制，转录和;无标题;表达外源基因常用的启动子 启;The Gal 1,10 pr;5) CUP1 promote;2）促进表达的其它序列元件Up;2. 外源mRNA在酵母细胞中;3. 外源蛋白在酵母细胞中的分;无标题;三. 重组蛋白质在哺乳动物细胞;? previousProme;2. 两个主要的表达系统1）;2）稳定基因表达系统 D;外源基因在昆虫细胞中的表达In;Characteristics;Extracellular e