第八章 目的基因的表达.ppt

第八章 目的基因的表达;第一节 基因工程中的基因表达;一、制约目的基因表达的因素 二、阅读框架 三、启动子的影响 四、终止子的影响 五、翻译过程对表达的影响;绝大多数的基因工程研究是以获得基因表达产物为目标。在构建重组体DNA分子和选择宿主细胞时，还须考虑外源基因表达的问题。 要求外来的基因在宿主细胞中能够准确地转录和翻译，所产生的蛋白质在宿主细胞中不被分解，而且最好还能分泌到细胞外。;当基因工程的目的为研究基因结构与功能的关系时，需将天然的或人工突变的基因片段插入含有一定报告基因的载体的适当部位，比较天然基因与突变基因对表达水平的影响，从而分析目的基因的结构与功能的关系。;外源基因是否插入在正确的阅读框架； 目的基因的有效转录（如启动子的作用）； mRNA的有效翻译（如SD序列等作用）； 转录后，翻译后的适当的修饰和加工过程。;一、制约目的基因表达的因素 二、阅读框架 三、启动子的影响 四、终止子的影响 五、翻译过程对表达的影响;阅读框架是由每三个核苷酸为一组联接起来的编码序列。外源基因只有在它与载体DNA的起始密码相吻合时，才算处于正确的阅读框架之中。 构建一组载体，使每个载体与相对于起始密码ATG的转译位相的位点不同，分别与外源目的基因拼接，即可获得所有可能的三位位相，其中必有一种位相可以保证外源基因处于正确的阅读框架中。;用人工接头可以调节阅读框架。市售的同一酶切点的人工接头一般都有三种长度，经与DNA片段连接，并切割成黏性末端后，各相差一个核苷酸。 因此，选择适当的人工接头，就可使外源基因处于正确的阅读框架中。;为了使外源基因表达，需要在基因编码顺序的5’端有能被宿主细胞识别的启动基因顺序以及核糖体的结合顺序。 两种常用的方法能用来使外源基因在宿主细胞中顺利地表达： 1) 在形成重组体DNA分子时，载体的启动基因顺序和核糖体结合顺序后面的适当位置上连接外源基因。 2) 将外源基因插入到载体的结构基因中的适当位置上，转录和翻译的结果将产生一个融合蛋白。这种融合蛋白质被提纯后，还要准确地将两部分分开，才能??得所需要的蛋白质。;一、制约目的基因表达的因素 二、阅读框架 三、启动子的影响 四、终止子的影响 五、翻译过程对表达的影响;原核细胞的转录过程中，决定外源基因表达的关键因素是外源基因必须在载体DNA的启动子控制之下，而且启动子又能被宿主细胞中的RNA聚合酶有效识别。;Roberts等(1979)构建了一系列重组质粒，各种质粒之间的区别仅在于启动子和结构基因cro之间的距离不同。将这些不同的重组质粒转化大肠杆菌后，发现cro蛋白质的水平在重组质粒间相差悬殊，最高值比最低值大2000倍。;启动子有强弱之分，强启动子指导产生较多量的mRNA，弱启动子指导下转录合成的mRNA很少。启动子的强度主要决定于启动子的结构。 在原核生物表达系统中，通常使用的可调控的强启动子有lac(乳糖启动子)、trp(色氨酸启动子)、PL和PR(λ噬菌体的左向和右向启动子)以及tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子)等。 为了在原核细胞中表达真核基因，必须将其克隆在原核启动子的下游，才能在原核表达系统中被转录。;一、制约目的基因表达的因素 二、阅读框架 三、启动子的影响 四、终止子的影响 五、翻译过程对表达的影响;①若干非必须的转录本的合成，会使细胞消耗巨大的能量用于制造大量非必须的蛋白质； ②在转录本上有可能形成一些不期望其出现的二级结构，从而降低了转译的效率； ③偶然会出现启动子阻塞现象，即克隆基因启动子所开始的转录干扰另一个必要的基因或调节基因的转译。;有些强启动子会通读，干扰质粒的复制，结果使质粒的拷贝数反而下降。 所以，在基因内部的适当位置上存在着转录的终止区，就能够保证使质粒的拷贝数（也就是基因的表达效率）控制在一个正常的水平上。;一、制约目的基因表达的因素 二、阅读框架 三、启动子的影响 四、终止子的影响 五、翻译过程对表达的影响;原核细胞在翻译水平上的调控是不严格的，只有RNA和核糖体的结合才是蛋白质合成的关键。;2) 起始密码AUG与SD序列之间的距离以及SD序列的核苷酸组成也影响翻译能力。;3) 起始密码之后的一个核苷酸对mRNA与核糖体的结合也有影响；直接位于起始密码子AUG左侧的密码三联体的碱基组成，同样会对转译的效率发生影响。;4)翻译的起始包括活化的30S核糖体亚基和mRNA5’末端区域间的互作，这时mRNA的5’末端已折叠成特殊的二级结构，基因表达水平的改变是mRNA二级结构的反映。;5) 基因末端的转录终止区的影响。 外源末端除要安装好的启动子，还要注意终止区的设置。;第二节 大肠杆菌原核表达体系 ;一、大肠杆菌表达系统的特点 二、大肠杆菌表达融合蛋白 三、大肠杆菌细胞包含体 四、提高克隆基因在大肠杆菌表达效率的途