聚乙二醇化重组人生长激素质控难点探讨.doc

聚乙二醇化重组人生长激素质控难点探讨 李晶 中检院生化及基因工程药物室 正文 重组人生长激素(Recombinant human growth hormone, rhGH)是由大肠杆菌或酵母菌表达的一种重要的非糖基化蛋白质激素，由191个氨基酸残基组成，相对分子量为22,125，等电点为5.2。临床上，rhGH主要用于治疗因内源性hGH缺乏而导致的儿童侏儒症、成人生长激素缺乏症等[1]。由于其体内半衰期仅为0.5~2hr左右，故需要每天、长期注射才能发挥疗效，治疗周期往往为一年以上[2]。聚乙二醇（Polyethylene glycols, PEG）是一种毒性极低的线性大分子聚合物，具有水溶性和免疫惰性。蛋白类药物经PEG修饰后，可延长半衰期，增加稳定性，同时降低免疫原性和抗原性[3]。2008年，第一个N端被枝杈型PEG修饰的rhGH进入临床试验[4]。虽然未发现严重不良反应且无抗PEG-rhGH的特异抗体产生，该产品却因为在二期临床试验中观察到注射部位出现皮下脂肪萎缩而被终止临床研究。目前，国内已有3家企业申报了3种PEG-rhGH注射液，其中一家企业已取得了临床批件。 虽然PEG-rhGH是在已收载于中国药典2010年版的比较成熟的重组人生长激素基础上进行研发的，但是，其质量标准中各项目及限度的制定不应简单地照搬rhGH的标准，还应结合其自身独特的理化结构性质及生物学活性，着重考虑PEG有关的质控项目。 1996年，美国Genentech公司的Clark等人利用分子量为5kDa的聚乙二醇（PEG），对重组人生长激素进行了长效改构研究[5]。研究结果表明，偶联后的重组人生长激素随着PEG偶联数目的增多，其体内半衰期也相应延长，但其与受体结合的活性及体内刺激大鼠胫骨增殖的活性却随着偶联数目的增加而急剧下降。同时，rhGH上可发生PEG修饰的10个位点中，有4个位点处于rhGH与受体的结合部位，直接影响着rhGH的活性。因此，每个rhGH分子究竟结合了几个PEG？这些PEG究竟结合在rhGH的哪些位点上？与这两个问题密切相关的两个指标——PEG对rhGH的平均修饰率与PEG在rhGH上的修饰位点就成为该类产品的重要质控指标与质控难点。 目前尚无国外产品的质量标准可供参考，国内企业与此相关的质控技术还有待于进一步完善。本文即从这两个质控关键技术进行讨论，并对质量标准制定中一些需重点关注之处进行说明。 1 PEG的平均修饰率 目前，PEG修饰蛋白的质量标准中平均修饰率的检测方法主要有：三硝基苯磺酸（TNBS）法、荧光胺法、质谱法、液相-示差/蒸发光检测器联用法等。其中，前两种为间接测定法，要求对修饰前后的蛋白质准确定量。该类方法属普通的化学与荧光发光法，操作相对简单；后两种属于直接测定法，虽然结果较为准确，但所用仪器较为特殊或昂贵。因此，建立质量标准时，应考虑采用直接法获得较为可靠的平均修饰率数值，随后建立三硝基苯磺酸（TNBS）法或荧光胺法而纳入标准。同时，如能成功建立直接法中的“液相-示差/蒸发光检测器联用法”，不仅可以准确控制单位点或多位点修饰的PEG-rhGH的平均修饰率，还可以同时进行游离PEG测定，以及PEG的定性鉴别。 1.1 质谱法 由于PEG的分子量较大，多采用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱（MALDI-TOF）测定修饰前后生长激素的质量数，将质量数之差除以PEG的分子量，即可得到每一分子rhGH上，发生修饰的PEG数目。但是，由于MALDI-TOF脉冲式的离子化方式不能精确定量，对于发生多点修饰的rhGH，只能用该方法计算PEG的结合数目，而无法准确计算平均修饰率。因此，该方法只适用于计算单位点修饰药物的平均修饰率。目前我国企业生产的3种PEG-rhGH，均为单位点修饰，利用MALDI-TOF测定的平均修饰率应为10%左右。 1.2 TNBS法 1966年，Habeeb等人采用三硝基苯磺酸（TNBS）与蛋白表面赖氨酸的ε-氨基和α氨基发生反应，生成在375nm处有特征吸收的三硝基苯酚（TNP）。对于采用游离氨基作为蛋白连接位点的PEG修饰蛋白，PEG修饰将直接减少蛋白表面的自由氨基，因此可以通过将吸光度值与蛋白浓度作图，求得PEG-rhGH与rhGH的斜率，将两者的斜率之差除以rhGH的斜率即可间接计算PEG的修饰程度。但是，该方法的影响因素较多，要求修饰前后的供试品中不得含有游离氨基，不得含有还原型物质，不得含有SDS等表面活性剂，并且极易受到环境温度、pH以及游离PEG的影响。同时，该方法中络合物随着反应时间的延长，吸光度值不断下降，需要考察适宜的反应中止方法以保证测定准确性。而rhGH国家对照品中因为添加了甘氨酸等赋形剂，不能直接用于TNBS法的检测。企业需考察 rhGH与PEG-rhGH在不含上述辅料