调节Matriptase2表达活化以和胞外段脱落（酶切）的分子学机制研究.pdfVIP

调节 Matriptase-2 表达，活化以及胞外段脱落（酶切）的分子学机制研究 中文摘要 调节 Matriptase-2 表达，活化以及胞外段脱落 （酶切）的分子学机制研究 中文摘要 目的： Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶（Type Ⅱ Transmembrane Serine Protease，TTSPs）是一类 通过氨基末端跨膜区域锚定在细胞膜上的蛋白酶，在哺乳动物的许多病理、生理过程 中扮演着重要的角色，其功能异常可导致癌症、缺铁性贫血、耳聋、心血管疾病等。 在人类，TTSPs 共有 17 个成员，其中对 matriptase-2 的研究比较少，目前对其生物学 功能的了解，主要是它可以通过调控 hepcidin 的表达来调节体内铁稳态；除此之外， 有研究表明它在乳腺癌和睾丸癌的发生发展过程中也起到一定的作用，但在这些疾病 的发生发展中，matriptase-2 的具体生物学功能并不明确。目前已知，matriptase-2 的 活化和胞外段脱落是其发挥自身功能的前提条件，但是对于调节 matriptase-2 表达， 活化和胞外段脱落（酶切）的分子机制仍不清楚。本研究旨在探究调节 matriptase-2 的表达，活化以及胞外段脱落（酶切）的分子学机制。 方法： （1）利用 RT-PCR，PCR 从人肝脏组织中提取出 matriptase-2 基因，然后连接到 带有 V5 标签的真核表达质粒中； （2）matriptase-2 重组质粒转染 HEK 293 和肝癌细胞，然后利用细胞免疫荧光技 术检验 matriptase-2 在这些细胞中能否成功表达； （3）免疫共沉淀收集条件培养基中的可溶性 matriptase-2 片段； （4）用生物素标记和免疫共沉淀分离、提取膜蛋白； （5）利用蛋白酶抑制剂，免疫共沉淀以及 western blot 探究哪类蛋白酶抑制剂能 抑制 matriptase-2 胞外段脱落； （6）利用点突变阻断对 matriptase-2 活性至关重要的两个位点，用来探究 matriptase-2 能否自身活化；同样地，利用点突变分别阻断 matriptase-2 上的七个糖基 化修饰位点，用来研究各个糖基化位点对 matriptase-2 的表达，活化和胞外段脱落（酶 I 中文摘要 调节 Matriptase-2 表达，活化以及胞外段脱落（酶切）的分子学机制研究 切）的影响； （7）Western blot 分析 matriptase-2 在细胞裂解液，上清以及膜蛋白中的表达， 活化以及胞外段脱落情况； 结果： （1）利用 RT-PCR 和 PCR 成功从人肝组织中提取到 matriptase-2 cDNA，连接到 带有 V5 标签的质粒后，经测序所有的碱基序列与人 matriptase-2 基因序列保持一致。 （2）重组 matriptase-2 质粒转染到人胚肾细胞 HEK 293 和肝癌细胞 BEL 7402 后， 利用细胞免疫荧光检测到锚定于细胞膜上的 matriptase-2，这表明我们所建立的细胞 模式很成功，能够用于以后的实验。 （3）用 Western blot 和免疫共沉淀分析 matriptase-2 在 HEK 293 和肝癌细胞 （BEL-7402、SMMC-7721、QGY-7703）中的活化情况。结果表明 matriptase-2 在 HEK 293 细胞中的活化和胞外段脱落（酶切）情况与在肝癌细胞中是一致的；其中~30