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第四章;细胞融合 单克隆抗体技术;第一节 细胞融合 一、细胞融合剂 二、细胞融合方式 三、细胞融合技术 四、杂种细胞的筛选;第一节 细胞融合;第一节 细胞融合;一、细胞融合剂;二、细胞融合方式;三、细胞融合技术;生物法;化学法：聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合;影响因素：;原理： 细胞在电场中极化成偶极子，并排列成串，然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜。;;甜菜原生质体电融合过程;注意事项;优点：;原理： 两种亲本细胞融合混合物中可有多种类型细胞，筛选目的是获得优良杂种细胞。; 同核体 异核体 多核体 异胞质体 核质体;1 植物细胞筛选方式;2）抗性互补筛选法 如：亲本1：放线菌素D＋，MS－ 亲本2：放线菌素D－，MS＋ 杂种细胞：放线菌素D＋，MS＋ 而亲本和其它细胞死亡;3）利用物理特性筛选法 亲本1：异硫氰酸荧光素（FITC）标记 亲本2：碱性蕊香红荧光素标记 荧光显微镜下，亲本1：绿色，亲本2：红色，杂种细胞可以区分;4）利用生长特性筛选法 如粉兰烟草与朗氏烟草细胞：外源激素 融合细胞：内源激素;动物细胞的筛选方式：;2）营养互补筛选系统 亲本A：色氨酸缺陷型 亲本B：苏氨酸缺陷型 杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，亲本细胞均死亡。;3）温度敏感突变型 亲本一：Kan＋，37度 亲本二：高温敏感突变型，Kan－ 杂种细胞能在高温和含Kan培养基生长。;第二节 单克隆抗体 一、抗体的结构与功能 二、单克隆抗体的制备和生产 三、单克隆抗体的改造和应用;;;抗体是由B细胞受抗原刺激后所分泌的蛋白质。;二、单克隆抗体的制备;单抗的特点;单抗的制备原理;单抗的制备过程;1.动物免疫与亲本选择;2）淋巴细胞 免疫方法 体内法 体外法 ;2.细胞融合;3.HAT培养基筛选杂交瘤细胞;细胞融合的选择示意图;1）HAT选择系统;原理： 杂交瘤技术中，常选用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷（HPRT-）或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤细胞为亲本之一，无补救途径。 含氨基喋呤培养基抑制了全合成途径。 淋巴细胞具有合成DNA的两条途径。 杂种细胞通过互补作用获得HRPT或TK基因，可应用培养基中次黄嘌呤及胸腺嘧啶核苷，通过补救合成途径合成DNA。 在HAT培养基中，HPRT- 或TK- 亲本细胞死亡，淋巴细胞亦逐渐死亡，只有杂种细胞存活。;2）特异性杂交瘤细胞的筛选;利用培养基对单抗进行鉴定的过程;一种制备人肿瘤单克隆抗体的方案;4.杂交瘤细胞的克隆化培养;有限稀释法;软琼脂培养法;5.单抗的大规模生产;三、单克隆抗体的改造和应用;单抗作为体内体外诊断试剂;1、单克隆抗体靶向制剂;2）药物通过小分子与单抗连接 通过一些小分子交联剂，把药物分子上的某些基团连接起来。 小分子交联剂：如同型双功能试剂，包括戊二醛、顺乌头酸酐、马来酸酐、戊二酐；异型双功能试剂：N－琥珀酰胺基－3－丙酸和寡肽等。 顺乌头酸酐制成的最常用;3）药物通过大分子与抗体相连 大分子聚合物：葡聚糖、多聚赖氨酸、多聚谷氨酸、聚合多肽和血清蛋白等。 总之，利用单抗试剂合可以作为靶向药物，针对肿瘤、自身免疫系统疾病、各种病原体病等。;2、杂交人－鼠单克隆抗体;3、人源单克隆抗体;4、抗体融合蛋白;5、抗体酶;6、单链抗体