DNA提取2011.pptVIP

讲课教师;组织DNA制备;主要内容;一、提取DNA总的原则：;二、样本来源(Specimen)：;血清、血浆、外周血有核细胞、痰液、体液、棉拭子采集的各种分泌物、组织（包括骨髓）和羊水等都是分子诊断的检验材料，其中全血、血浆（血清）标本占分子诊断的60%以上 ;DNA提取前样本采集、预处理和保存：;（二）血浆和血清(plasma and serum);血浆DNA又称为循环DNA，是一种无细胞状态的胞外DNA，主要是游离的单链、双链DNA或DNA-蛋白质的混合物 它在未来分子诊断的应用中具有广阔前景 血浆DNA成分的来源分为内源性和外源性两个部分，其中入侵的病毒、细菌等病原体释放入血液的核酸是外源性血浆DNA最重要的成分; 血浆DNA (plasma DNA);（三）体液;（四）分泌物;结核分枝杆菌的检测，可以用NaOH液化痰液去除粘液和蛋白质；非结核分枝杆菌的核酸，使用生理盐水后取上清液 痰液检测病原体核酸不适宜作定量分析，检测时尽可能提高痰液中细胞成分的回收率 ;三、DNA提取的基本步骤;各种组织细胞破碎方法;破裂细胞 、释放核酸;2、核酸的分离与纯化(isolation and purity)： 将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其 他物质分离 非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂 类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液;3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤 沉淀可去除部分杂质与某些盐离子 加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等） 少数盐类可使用70-75%的乙醇洗涤;4、DNA鉴定(DNA identification);浓度鉴定(concentration identification); 各种碱基的紫外吸收光谱;2）荧光光度法 荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。 适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（1-5ng）;EB与DNA的结合 ;500?l全血提取的基因组DNA电泳;纯度鉴定(purity identification);完整性鉴定(integrity identification);;5、核酸的贮存——DNA保存 (storage);主要内容; （一）酚抽提法： 先用EDTA、 SDS 、蛋白酶K破碎细胞，消化蛋白，然后用pH8的Tris饱和酚或酚-氯仿抽提DNA，最后乙醇或异丙醇进行沉淀。获DNA大小为100－150kb。;DNA酚抽提法示意图;主要试剂的作用： EDTA：1 二价金属螯合剂，抑制核酸酶； 2 降低细胞膜的稳定性;SDS的作用： 1、溶解膜蛋白和脂肪，从而是细胞膜破裂 2、溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸 释放出来 3、对RNA、DNA酶有抑制作用 4、与蛋白质形成R-O-SO3 …R蛋白质复合物，使蛋白质变性;蛋白酶K(protenase K)： 水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中的蛋白质 蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能 力，而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性，可 同时使用;苯酚(phenyl hydroxide )的特点： 蛋白质强变性剂、抑制DNA酶活性 苯酚溶于有机溶剂，微溶于水 提取DNA前苯酚用Tris-Hcl饱和，防止吸收过多DNA，降低DNA的损失率 氧化苯酚会破坏DNA;为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离？;PH8.0的Tris溶液可以使抽提出的DNA进入水相，减少在蛋白质层滞留。 在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是可以减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保持分相的稳定性。 ;DNA的沉淀;（二） 甲酰胺解聚法： 破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA。高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与DNA的复合物，可以使蛋白质变性。减少了酚多次抽提的步骤 甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的DNA样品。可得DNA 200kb左右。;（三） 玻璃棒缠绕法： 用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅，DAN沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb ;DNA玻棒缠绕法示意图;DNA提取试验中常遇到的问题;DNA降解的原因 样本不够新鲜，采集材料过陈旧 样本本身存在大量DNA酶 提取DNA的生物活性差的原因？ 提取的基因组DNA盐浓度过高 基因组DNA中乙醇未清除净 基因组DNA中可能存在其他抑制因素 提取基因组DNA，有时加入蔗糖的原因 加入多糖，保护DNA长度;主要内容;实验步骤; 6. 吸上清液至新离心管中，加入5mol/L NaCl至终浓度 0.3