第四次分生讨论课问题四整合技巧.ppt

基因工程设计方案;有关该题目的具体分析;该问题我们主要分五个个方面来实行实验方案;1.目的基因的获取;（1）对资料gene bank 中的基因的分析;以下是查找到的全长基因序列;（2）cDNA的获取;Ⅰ.小鼠卵透明带糖蛋白2的mRNA的提取Ⅱ. mRNA的逆转录为cDNA;Ⅲ. cDNA形成双链进行扩增 ;（3）cDNA的扩增;设计引物的过程：;;cDNA的扩增;（4）cDNA的后续处理;2.表达载体的选择与构建;（2）表达载体的构建;PCR引物的选取原则;目的基因导入受体细胞;植物遗传转化的主要方法;转基因动物; （受精卵原核）显微注射法;逆转录病毒感染法 (小鼠、家禽);胚胎干细胞（Embryonic stem cells）法; 目的基因的筛选与鉴定 制作人---莫思凡 ;; 遗传学方法;;; 当外源DNA片段插入真核表达载体DNA的BamHⅠ或SalⅠ位点时，抗四环素基???失活（Tetr Tets ），重组体转化子必定具有AmprTets表型。因此，将转化菌先涂布在含有Amp的琼脂平板上，并将存活的Ampr菌落原位影印到另一个含有Tet的琼脂平板上，凡是在Amp平板上生长，而不在Tet平板上生长的菌落，就必定是已经插入了外源DNA片段的重组质粒转化子克隆.;;（二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法;（二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法;;;　　将噬菌体感染形成的噬菌斑影印在硝酸纤维膜上变性 ?带有目的基因的放射性DNA或cDNA作探针进行杂交?放射性自显影 ?杂交信号（黑点）对应的噬菌斑即为阳性克隆。; 菌落印迹原位杂交的优点是：适于高密度菌落的筛选,对于噬菌斑平板,它可以连续影印几张同样的硝酸纤维滤膜,获得数张同样的DNA印迹。因此，能够进行重复筛选，效率高，可靠性强，而且可以连续使用两种或数种探针筛选同一套重组体DNA，是一种最常规的检测手段。;(2) 核酸分子杂交： 　①.Southern杂交分析：由英国Southern（1975）发明，将琼脂糖中DNA转移到尼龙膜?进行DNA分子杂交分析的方法。 　　筛选基因库得到阳性克隆? 将限制性酶酶切与Southern杂交 结合?绘制限制性酶图谱。;②.Northern杂交分析： 与Sorthern杂交的原理和 程序相同。 　　用于分析克隆的基因在某一细胞或组织的转录水 平，检测mRNA的存在。; 物理检测法(酶切鉴定);