第2章工具酶要点.pptVIP

第二章 基因工程中的工具酶 主要内容 第一节 限制性核酸内切酶1.1 限制修饰原理1.2 限制修饰系统类型及特点1.3 限制性内切酶1.4 基因工程中对宿主限制修饰的要求 第二节 DNA 连接酶 2.1 DNA连接酶连接DNA分子的机理 2.2 体外连接DNA的反应条件 2.3 连接方法 2.4 无需连接酶的连接方法 第三节 其他工具酶 3.1 DNA聚合酶 3.2 碱性磷酸酶 3.3 T4 多聚核苷酸激酶 基因工程的工具酶 应用于基因工程实验的各种酶的总称，主要有核酸酶、聚合酶、连接酶等。（表2.1） RNAase DNA聚合酶 连接酶 激酶 磷酸酶 DNase RNA聚合酶 内切核酸酶 外切核酸酶 主要内容 第一节 限制-修饰系统及限制性核酸内切酶1.1 限制-修饰系统的发现及原理1.2 限制-修饰系统类型及特点1.3 限制性核酸内切酶简介1.4 基因工程中对宿主限制修饰的要求 1.限制修饰系统及限制性核酸内切酶 （2）限制性核酸内切酶的定义 简称限制酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（多为4-8bp），并由此处(或在此处附近）切割DNA双链的核酸内切酶。 （1）限制与修饰的含义 限制(restriction)作用是指细菌的限制性核酸内切酶对DNA的分解作用，限制一般是指对外源DNA侵入的限制。 修饰(modification)作用是指细菌的修饰酶对于DNA碱基结构改变的作用(如甲基化)，经修饰酶作用后的DNA可免遭其自身所具有的限制酶的分解。 限制修饰系统是原核微生物细胞的一种自我保护系统。 主要内容 第一节 限制-修饰系统及限制性核酸内切酶1.1 限制-修饰系统的发现及原理1.2 限制-修饰系统类型及特点1.3 限制性内切酶简介1.4 基因工程中对宿主限制修饰的要求 1.1 限制-修饰系统的发现及原理 1952年，卢里亚发现一种细菌的自我保护现象：从某菌株中分离的噬菌体再次感染该菌株的效率为100%，但感染其他菌株的效率极低。此现象称为限制与修饰 其原理为： 细菌利用限制酶特异性识别噬菌体DNA并在其识别位点切断它，导致噬菌体DNA的降解，但细菌自身的DNA则通过修饰酶进行修饰加以保护，以阻止限制酶的作用。 这两种酶应该具有相同的专一性的DNA识别位点 1.1 限制-修饰系统的发现及原理 1968年，马特·梅索森分离到第一种限制酶EcoK，阿尔伯也在同年分离到限制酶EcoB 但这两种酶切割DNA具有随机性，不符合上述理论对限制酶的要求。 1970年，史密斯分离出限制酶HindⅡ，并证明其具有精确的切割位点和识别序列。 1970年，纳森斯以动物致瘤病毒SV40为基础，制作了第一张限制酶切图谱。 随后更多的修饰-限制系统被发现，从而完全证实了阿尔伯提出的理论。 限制-修饰系统举例 1.1 限制-修饰系统的发现及原理 主要内容 第一节 限制-修饰系统及限制性核酸内切酶1.1 限制-修饰系统的发现及原理 1.2 限制-修饰系统类型及特点1.3 限制性核酸内切酶简介1.4 基因工程中对宿主限制修饰的要求 （1）限制修饰现象 （2）阿尔伯的理论预测 （3）限制酶的发现 1.2 限制-修饰系统的类型与特点 一种酶，由3个分别行使切割、甲基化和识别序列的亚基构成。首先由M.Meselson等在1968年从大肠杆菌 K株分离：EcoK 1.2.1 I型限制－修饰系统 1.2 限制-修饰系统的类型与特点 两种可识别相同DNA序列的酶，一种是限制酶，另一种是甲基化修饰酶，均为同型二聚体。首先由H.O.Smith等在1970年从流感嗜血菌中分离出来。分离的第一个酶是Hind Ⅱ 1.2.2 II型限制修饰系统 5’-CTGCAG-3’ 3’-GACGTC-5’ （2）切割位点: 切割位点在识别位点处：切开双链DNA，形成粘性末端（sticky end）或平齐末端（blunt end）。 Pst I 5’-CTGCA?G-3’ 3’-G?ACGTC-5’ 产生粘性末端 EcoR V 5’-GAT?ATC-3’ 3’-CTA?TAG-5’ 产生平齐末端 1.2 限制-修饰系统的类型与特点 双链DNA的一条链突出数个核苷酸的末端，称为粘（性）末端 1.2 限制-修饰系统的类型与特点 两种可识别相同DNA序列的酶，一种是限制酶，另一种是甲基化修饰酶。 1.2.3 IIs型限制－修饰系统 1.2 限制-修饰系统的类型与特点 一种