第四章基因工程的载体-质粒二要点.ppt

一、λ噬菌体的分子生物学 　　 第三节λ噬菌体载体 λ噬菌体的生活史 λ噬菌体基因大致分为4个区： 结构区A～ J19个基因，编码头、 尾部蛋白质为结构区,重组区 att（attachment）、int（intagrate）及xis（excission），调控区启动子、终止子和NuI基因， O-R 为裂解区。 1 ? 噬菌体发育调节 ①吸附 ②立即早期转录 ③ 延迟早期转录 ④溶源和裂解的感染分化 ⑤进入裂解生长 ⑥溶源化 ? 噬菌体的可取代区 J 基因与 Cro 基因之间的 DNA 被 ga1 基因或 bio 基因替换后，不影响 λ 噬菌体裂解生长。这个区段约占λ噬菌体 DNA 的 1/3 ，主要包含控制λ噬菌体进入溶源状态的调节基因和功能基因 2 λ噬菌体载体的选择标记 2.1 基因组大小 重组λ噬菌体的基因组 DNA 太大或太小会影响其存活能力。外源 DNA 片段的大小将在 9-23kb 范围内 2.2 lacZ 基因 ?lacZ 基因也可用于 λ 噬菌体载体，通过插入或替换载体中的 β-半乳糖苷酶基因片段，在 IPTG/X-gal 平板上可通过噬菌斑的颜色，筛选重组噬菌体 λ噬菌体载体的选择标记 2.3 基因 cⅠ 失活 基因 cⅠ 是 λ 噬菌体的抑制基因，全面抑制并阻断基因的表达 。如果外源 DNA 片段插入基因 cⅠ 中，将高频率地使 E.coli 进入裂解生长状态。 2.4 Spi 筛选 通过λ噬菌体载体 DNA 上的 red 和 / 或 gam 基因的缺失或替换，可在 P2 噬菌体溶源性细菌中鉴别重组和非重组λ噬菌体。 3.代表性λ噬菌体载体 3.1 插入型载体 　通过特定的酶切位点允许外源 DNA 片段插入的载体称为插入型载体。由于 λ 噬菌体对所包装的 DNA 有大小的限制，因此一般插入型载体设计为可插入 6kb 外源 DNA 片段，最大 11kb 。 　 ? λgt10载体 　　　大小为 43340bp ，是经典的 ? 噬菌体载体，主要用作 cDNA 克隆，允许的插入片段大小为 0-6kb 。 　　　　　 ?gt11 载体 大小为 43.7kb ，是一个常用的载体。?gt11 载体允许插入的 DNA 片段大小为 0～7.2kb 。它用于构建 cDNA 文库、基因组文库和表达融合蛋白。 　　该载体最大的特点是在最左侧可替代区置换了一段 lac5 基因，可编码 ?-半乳糖苷酶，在 IPTG/X-gal 平板上形成兰色噬菌斑。 　　lac5 基因编码区终止密码子之前有一个 EcoRⅠ 位点（53bp 上游），可用于外源 DNA 片段的插入。 　　筛选时，在 lac- 宿主菌中非重组噬菌斑为兰色。当外源 DNA 片段与 lacZ 的阅读框相吻合时，可表达出融合蛋白，可用免疫学方法筛选阳性重组子。 ?GEM-2/4 ?GEM-2 和 ?GEM-4都是由 ?gt10 改造而来，也是 cDNA 克隆载体 ?ZAPⅡ?????ZAPⅡ 整体上与 ?gt11 相似，不同的是在基因 J 和 att 位点之间用 pBluescript SK 质粒片段取代了相应的 ? 噬菌体片段，允许插入 0-10kb 的外源片段。因此，该载体具备了 pBluescript SK 质粒的一些特性，如 ?-互补以及可通过启动子合成 RNA 探针。 ?Excell?????Excell 大小为 45.5kb ，与 ?ZAPⅡ 相似。不同的是，在该载体中装载了 pExCell 质粒载体片段（4190bp）。该载体允许外源 DNA 插入的大小为 0-6kb ，主要用于 cDNA 克隆。 pExCell 与 pBluescript 载体相似，除了多克隆位点不同外，插入了一段来自 ? 噬菌体的片段。该片段含有 ? 噬菌体整合到大肠杆菌染色体所必须的整合位点 att 。  3.2 置换型载体 允许外源 DNA 片段替换非必须 DNA 片段的载体，称为置换型载体（replacement vectors）。一般情况下，置换型载体克隆外源片段的大小范围是 9-23kb ，故而该载体主要用来构建基因组文库。 EMBL3 和 EMBL4 ? 这两个载体大小为 43kb ，其左臂、右臂和填充片段的大小分别为 20kb、 9kb 和 14kb 。从提高克隆效率角度来看，它们克隆 DNA 片段的大小为 9-23kb 。在填充片段中带