Pcr的发展史试题.pptx

Pcr的发展史 专业：作物遗传育种 姓名：李宇峰 背景 Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想:“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。但由于当时基因序列分析方法尚未成熟，热稳定DNA聚合酶尚未报道以及引物合成的困难，这种想法似乎没有实际意义。加上70年代初分子克隆技术的出现提供了一种克隆和扩增基因的途径，所以，Khorana的设想被人们遗忘了。 Pcr的原理及反应体系 原理： DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 反应体系 Pcr的发展过程 Pcr的实现：1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA ，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。 Pcr的改善：（1）Mullis最初使用的 DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温， 90℃会变性失活，每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。 此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。 （2） 1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。 （3）1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。 ②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度 (2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。 样式不同的pcr仪 Pcr的四个技术革新 第一代：机械手式水浴箱基因扩增 三个水浴箱恒定三个温度，94o 58o 72o 优点：设备简单，费用低，试验时间段，更接近pcr理想状态。 缺点：劳动强度大，易出错 第二代：自动化控制型定性基因扩增仪 优点：具有代表性的扩增仪，是三代，四代仪器 的基础。 缺点：①无法对初始模板精确定量 ②无法实时监测扩增情况 ③跑胶麻烦，易污染 第三代：终点定量 优点：可以评价待定核算的浓度及定量分析 第四代：实时定量pcr 实时定量Qpcr仪+实时定量试剂+通用电脑+自动分析软件，构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量监测系统 研究意义 PCR技术问世以来正以惊人的速度发展，不仅其本身不断地优化改进，许多新型的PCR技术或由PCR衍生的新技术正不断出现。在PCR技术的启发下，诸如转录依赖的扩增系统(TAS)、连接酶链反应(LCR)、自主序列复制系统(3SR)、链替代扩增(SDA)、循环探针反应、等温扩增系统等核酸体外扩增技术不断诞生。当然，目前Mullis发明的经典PCR技术，仍是多数实验室进行核酸体外扩增时的首选和最常用的技术。 THANKS