基于双功能化金-量子点纳米复合物的荧光放大策略的构建及用于癌细胞表面甘露糖的检测详解.docx

基于双功能化金-量子点纳米复合物的荧光放大策略的构建及用于癌细胞表面甘露糖的检测摘要：细胞表面的多聚糖由一系列复杂的生物分子构成，与癌细胞的生长、分化息息相关。因此，细胞表面多聚糖的分析检测对于早期癌症的诊断和治疗非常重要。本文基于双功能化金-量子点纳米复合物的荧光放大策略，通过竞争机制检测癌细胞表面的甘露糖。其中，癌细胞和巯基化的甘露糖衍生物在溶液中相互竞争，结合至ConA-AuNRs-电极表面。实验中，我们将量子点（QDs）修饰到BSA-金纳米颗粒上，接着，利用金-硫键将巯基化的甘露糖衍生物进一步修饰到纳米粒子表面，这样我们制得了具有荧光信号的{QDs-Au-BSA-mannose}纳米复合物。由于在该纳米复合物中，BSA将量子点和金纳米粒子隔开，因此该复合物仍然保持量子点的荧光特性，并且对ConA-AuNRs-电极具有很强的结合作用。本实验成功分析了两种癌细胞（A549和QGY-7701）表面的甘露糖，该检测方法简单，在实际样品中用于检测癌细胞表面的多聚糖具有广阔的应用前景。关键字：金-量子点纳米复合物，甘露糖，荧光，癌细胞引言糖基化是共转译和后转译蛋白修饰过程中最常见的形式。糖基化异常会导致多聚糖的不同表达，这与许多生物学过程密切相关，例如炎症、胚胎发育、细胞信号传递和自身免疫刺激[1-5]，多聚糖表达的改变是癌细胞具有的通性，能够调控肿瘤演变的许多方面，包括增殖、入侵和转移[6-8]。例如，研究表明大肠癌细胞表面唾液酸的表达比正常细胞的高出很多倍[9]。另外，乳腺癌细胞中甘露糖的表达也是远远高于其他细胞的[10]。因此，为了更多地了解多聚糖在癌症发展中的作用并将其应用于癌症的早期诊断和治疗，癌细胞表面多聚糖的检测显得尤为重要。过去的几十年中，已经有许多方法用于多聚糖的检测，比如质谱、核磁共振光谱和色谱等[11-14]。其中，有些技术提供了多聚糖的定量检测信息和结构分析。然而，这些技术存在癌细胞样品在准备阶段被破坏、检测过程较复杂等缺点，因此将这些方法应用于活的癌细胞分析仍不令人满意[15]。凝集素具有高效性和多样性（包括各种天然或人工合成的凝集素），近来，基于凝集素-多聚糖的相互作用实现对多聚糖的分析检测吸引了广泛关注[16-20]。目前，由于荧光技术具有许多优点，如相对温和的样品准备过程和快速的信号输出，荧光检测已经广泛应用于各种生物分子的检测，包括蛋白质、多肽和DNA[16,17,21]。在多数常见的荧光检测中，因为有些分析物缺少荧光基团不能产生荧光信号，因此我们将荧光标记物标记到分析物上再进行相关检测[22-24]。然而，这些方法通常存在检测时间长和修饰过程复杂等缺点，因而不适用于活细胞的分析检测[25]。因此，竞争机制是个很好的方法来实现活细胞分析这个目标[26]。目前，科学家们将纳米技术和生物科学联系在一起，广泛将纳米材料应用于生物传感技术中。纳米材料可以用作固定基质、催化试剂和信号放大标记物等。例如，各种形状的金纳米材料（纳米粒子、纳米棒、纳米花到纳米线）已经制备出来，许多学者正在研究他们不同的性质[27-29]。其中，金纳米粒子具有稳定的性质、良好的生物兼容性等优点，因而最广为研究[30-32]。此外，蛋白质保护的金纳米粒子同时具有样品制备和后修饰过程简单的特性，已经成功应用于生物传感器领域中[33]。本论文基于竞争机制和具有荧光特性的双功能纳米生物复合物，实现了活细胞表面多聚糖的检测。甘露糖是糖基化中多聚糖重要的结构之一，其表达的改变在癌症发展和分化中起着重要的作用。本实验研究了人体肺癌细胞和肝癌细胞表面甘露糖的表达。其中，电极表面修饰的金纳米棒可以固定凝集素ConA，因为ConA能够与甘露糖特异性结合，因此可以将此电极作为一个竞争平台，使癌细胞和双功能化的纳米生物复合物通过竞争结合至电极表面。实验中，我们将量子点（QDs）修饰到BSA-金纳米颗粒上，接着，利用金-硫键将巯基化的甘露糖衍生物进一步修饰到纳米粒子表面，这样我们制得了具有荧光信号的{QDs-Au-BSA-mannose}纳米复合物。本实验能够得到灵敏的荧光信号，为活的癌细胞表面甘露糖的研究提供了检测依据。实验结果显示，这两种癌细胞具有不同的糖表达水平，这与荧光显微镜的结果是一致的。当然，如果改变凝集素种类，此方法也可以检测活细胞表面许多其他的多聚糖表达。2实验部分2.1化学试剂伴刀豆球蛋白（Con A）、牛血清白蛋白（BSA）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和细胞培养试剂均购于Sigma公司；细胞株（A549和QGY-7701）购自中国科学院细胞库；氨基化的量子点CdSe/ZnS购自武汉珈源量子点技术开发有限公司；甘露糖、抗坏血酸、硝酸银（AgNO