磁珠羧基含量对灵敏度影响.docVIP

磁珠羧基含量对灵敏度影响 一、磁性纳米颗粒的氨基化 SiO2/ PMMA/Fe3O4 磁性纳米颗粒进行修饰首先将15 mg（22.5 mg/mL）667 μL SiO2/ PMMA/Fe3O4 纳米颗粒磁分离加入3 mL乙醇/水（2.985/0.015）混合溶液中为了更好的分散Fe3O4颗粒需将该溶液进一步超声0 min。然后将6 μL APTS滴加到以上混合溶液中并在室温（25 ℃）下振荡搅拌7小时（用塑料管做）。最后利用外加磁场将APTS修饰的磁性颗粒从反应介质中分离出并用乙醇溶液对其清洗5次磁分离再用 mL DMF（二甲基甲酰胺）清洗5次最后以的5 mg/mL的浓度分散在DMFμL）中待用二、羧基化磁珠的制备（粒径400nm）共00 μL 取氨基化SiO2/ PMMA/Fe3O4 纳米颗粒的DMF溶液600 μL 5 mg/mL 分别逐滴的加入到600 μL含丁二酸酐 Succinic anhydride，SA 0.0001，0.001，0.01和0.1 mol/L的DMF中20℃下反应24 h后用水洗涤数次后磁分离加ddH2O μL 定容至10 mg/mL三、磁珠羧基含量影响效果测定 测定各浓度磁珠的吸光值并将其同时放在磁场中磁分离20分钟后测定相应的吸光值计算比率四、磁珠的封闭（磁珠上含有羧基和氨基氨基带正点可吸附探针造成影响） 八只小管μL）分成两组： 一组（编号1，2，3，4）：分别为0.00010.001，0.01，0.1 mol/L，不做任何处理。 二组（编号5，6，7，8）：浓度分别为0.0001，0.001，0.01，0.1 mol/L，分别加入含乙酸酐10 % v/v 的乙腈溶液，孵育1 h，进行封闭，并清洗。 五、羧基化磁珠的核酸修饰将 μL羧基化磁珠（10 mg/mL）用等体积 25mM MESpH 6，反复清洗2次磁分离 加入 μL用25 mM MESpH 6稀释的氨基化探针（100 μmol/L）到洗过的磁珠中 磁珠上探针的浓度为00 pm/mg ，混合均匀后室温下温和旋转孵育30 min 立刻用冷的25 mM MESpH 6溶解EDC（10 mg/ml） 加入 μL EDC 溶液 0. mg 到磁珠中混合均匀 再加入 μL 25 mM MES，pH 6 至 μL。 在4℃旋转孵育2 h或更长时间（过夜）。 磁分离4 min后吸去上清。为了中和没有反应的活化羧酸基团，将磁珠孵育在 μL，50 mM TrispH 7.4，15 min；用50 mM Tris + 0.1 % Tween-20清洗磁珠4次。PBS加0.1 %的BSA封闭磁珠。 最后在加入0.02 % w/v 的叠氮化钠 NaN3 ，起到抑菌的作用。4度保存。 如果储存时间超过2周，用时需用PBS+BSA清洗5 min。 、O157特异基因的检测 Biotin标记O157特异序列的获取 取30 μ探针修饰磁珠（10 mg/ml）磁分离后吸去上清，在30 μ反应体系中分别加入的杂交液（Invitrogen, USA）10 μ、ddH2O 18 μL和不对称PCR产物μL，混匀后在热盖温度为102 ℃的PCR仪中95 ℃变性10 min，50 ℃杂交1 h，每20 min混匀一次。 经60 μ 2×SSC-0.1% SDS、0.1×SSC-0.1 % SDS 和洗涤液（50 mM Tris，pH 7.5，0.15 M NaCl）各振荡、清洗3 min（提前将上述清洗试剂放在45 ℃的孵育器中，SDS温度低于42 ℃会析出！），最后磁分离吸去上清。 加入60 μ封闭液（洗涤液+0.25 % BSA+0.1 % Tween 20）混匀后室温放置30 min，期间不断混匀。 磁分离后吸去上清，加入1:4000酶稀释液（封闭液稀释的碱性磷酸酶标记的链亲和素）30 μ，混匀后室温孵育30 min。 磁分离后加入60 μ洗涤液用枪头吹打30次，轻轻吸出后转移至新的0.5 m离心管中，磁分离后吸去上清，再加入洗涤液吹打清洗2次吸去上清液。 加入0.25 mM的AMPPD（0.1M Tris-HCl缓冲液溶解，1 mM MgCl2）300 μ。充分混匀后，分别取100 μ于白色微孔板的一个孔中，测定40分钟内的化学发光强度时间曲线。