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溶剂系统对RP―HPLC分离性能的影响 　　摘要：反相高效液相色谱（RP-HPLC）中所用的溶剂系统是影响其分离性能的重要因素之一。本研究以尿嘧啶、苯酚、萘、芘、联苯、1-萘酚、2-萘酚、邻甲酚为标准样品，考察了溶剂强度、溶剂极性等对反相色谱分离性能的影响。采用溶剂三角形法优化了多组分样品分离的溶剂体系，得出最佳分离溶剂系统为甲醇/水（1∶1，V/V）。在此条件下，对中药茶多酚及大黄提取物进行了分离，效果较好。 　　关键词：反相高效液相色谱（RP-HPLC）；溶剂系统；溶剂三角形 　　中图分类号：O657.7 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）09-2226-03 　　反相高效液相色谱（RP-HPLC）是液相色谱中最常用的模式，广泛应用于化工、制药、生物工程等领域。RP-HPLC溶剂系统的选择与优化一直是液相色谱领域的热门研究课题[1，2]。尽管目前在这一方面有很多文献可供参考，但对于多组分目标物的分析与分离，仍存在很多问题，且有效选择并优化色谱的溶剂系统也十分困难[3-5]。本研究在考察了溶剂系统的强度、极性等参数对RP-HPLC分离性能影响的基础上，使用简便易行的三角形法优化多组分体系分离的溶剂体系，进而得出最佳分离溶剂体系，并应用于中药提取物的分离。 　　1 材料与方法 　　1.1 仪器与试剂 　　LC-10ATVP高效液相色谱仪配有SPD-10AVP紫外检测器（日本岛津公司）与N2000色谱数据工作站（浙江大学智达信息工程有限公司）。SB2200超声仪（上海申波超声公司）。 　　所用试剂均为分析纯，购于国药集团。水为去离子水。中药茶多酚及大黄原料为市售。所有标准样品质量纯度不低于95%。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 色谱分析条件 色谱柱为Agilent SB C18柱；流动相为不同比例的反相溶剂体系；流速为1.0 mL/min；检测波长为254 nm；检测温度为25 ℃；进样体积为2 ？滋L。 　　1.2.2 标准样品的配制 以甲醇/水（1∶1，V/V）作溶剂，分别配制如下标准溶液：尿嘧啶（1 mg/mL）、苯酚和2-萘酚（4 mg/mL），其余样品萘、芘、1-萘酚、邻甲酚、联苯均为2 mg/mL。取等体积各样品配制多组分混合标准溶液。 　　1.2.3 不同溶剂体系下混合标准溶液的测定 配制不同溶剂强度的甲醇-水溶剂；配制等强度的甲醇-水、乙腈-水及四氢呋喃-水溶剂；配制相近极性的异丙醇-水、乙腈-水及四氢呋喃-水混合溶剂；分别以上述溶剂为流动相，在“1.2.1”的色谱条件下测定混合标准溶液的保留值。各溶剂比例见结果与分析部分。 　　1.2.4 溶剂系统的优化及分离应用 采用溶剂三角形法优化混合标准溶液的分离效果，具体方法见结果与讨论部分。采用超声提取大黄及茶多酚原料，过滤得到提取液，在优化得到的溶剂体系下，对提取物进行测定。 　　2 结果与分析 　　2.1 溶剂强度对分离选择性的影响 　　图1为在不同甲醇水体系下，混合标准溶液的色谱图。随着强洗脱溶剂强度的改变，所选择的标准样品的分离选择性发生了很大的变化。增加溶剂中的水的比例，所有样品分离结束的时间显著增加，由甲醇/水（8∶2，V/V）下的22 min增加到甲醇/水（6∶ 4，V/V）下的210 min，但分离效果逐渐改善，甚至样品中含有的少量未知杂质也可有效分离，见图1c。 　　2.2 等强度下不同溶剂体系对分离选择性的影响 　　图2为等强度不同洗脱体系下，混合标准溶液的分离色谱图。所用的溶剂甲醇/水（4∶6，V/V）、乙腈/水（46∶54，V/V）和四氢呋喃/水（33∶67，V/V）强度相同，但由测定结果可知，不同溶剂对混合标准溶液中5种组分的分离选择性不同。 　　2.3 相近极性的不同溶剂体系对分离选择性的影响 　　5种组分的混合样品在相近极性（约为8）的不同溶剂体系下的分离如图3所示。由测定的色谱图结果可知，乙腈/水（51∶49，V/V）作为溶剂分离5种混合标准溶液所用时间最短，8 min内即可完成分离。四氢呋喃/水（35∶65，V/V）溶液作为溶剂分离5种混合标准溶液所用时间最长，分离色谱峰峰型也较差。 　　2.4 溶剂三角形优化及实践应用 　　采用溶剂三角形法寻找适合多组分分离的反相色谱溶剂体系，其选择溶剂的过程就是在三角形上寻找优化的流动相组成，使之达到理想的分离。通常可以应用能使各峰产生“最好”分离的3种流动相作为一个新三角形的顶点。如此反复进行试验，最终得出最好的分离点。在RPLC中最常用的3种溶剂为甲醇、水和乙腈，为此，本试验使用这3种溶剂作为首次使用的溶剂三角形的顶点，如图4a所示，分别以图形中的1、2、3、4点所构成的溶剂比例进行试验，分离5组分混合样品。定义