膀胱癌分子标志物基质金属蛋白酶1的可溶性表达和尿液中的活性分析.docVIP

膀胱癌分子标志物基质金属蛋白酶1的可溶性表达和尿液中的活性分析 　　摘 要 通过分离人胚胎肾细胞（HEK293）中基质金属蛋白酶1（MMP1）基因序列，利用基因工程技术在大肠杆菌中表达并纯化了包涵体复性的MMP1；采用融合表达硫氧还蛋白（Thioredoxin，TrxA）的方法获得了可溶性的MMP1TrxA复合蛋白，在TrxA蛋白和MMP1活性中心之间引入了一个肠激酶切割位点，通过酶切作用获得可溶性MMP1。明胶酶谱分析法对体外表达的MMP1和体内（尿液中）MMP1进行了分析比较。结果表明，TrxA蛋白能够显著提高MMP1的可溶性，且可溶性MMP1的明胶降解活性是复性的MMP1降解活性的 1.54倍，与尿液中的MMP1的明胶酶降解活性相当。因此，明胶酶谱法是一种有效的、高灵敏的MMP1检测方法，所表达的可溶性MMP1为小分子探针筛选提供了更可靠的分子靶点。 　　关键词 膀胱癌生物标志物； 基质金属蛋白酶； 分子探针筛选； 明胶酶谱 　　1 引 言 　　目前，由膀胱癌引起的男性致死率处于上升趋势。尽管对膀胱癌的诊断和治疗技术已有了很大提高，但膀胱癌患者的生存率仍然不佳，迫切需要针对膀胱癌术后复发的诊断技术[1]。寻找新型膀胱癌标志物，开发非侵入性、高敏感性和特异性、操作简便、费用低廉的检测技术，将提高膀胱癌的早期诊断水平，达到及时治疗的目的[2，3]。 　　基质金属蛋白酶（MMP）也被称为间质胶原酶和成纤维细胞胶原酶，同肿瘤的发生和发展过程密切相关，在胰腺癌、前列腺癌、大肠癌和乳腺癌中的表达都有升高[4，5]。有研究表明： 在膀胱癌患者尿液中，MMP1可以作为新型生物标志物，用于预测患者是否会发展为晚期或者高级膀胱癌[6，7]。目前，临床主要使用酶联免疫吸附分析法（ELISA）对尿液样本中的MMP1进行检测，但该方法耗时、尿样制备复杂，容易导致蛋白降解以及蛋白酶失活。因此，在膀胱癌诊断过程中迫切需要针对MMP1检测的简单、灵敏、快速的检测技术。 　　对基质金属蛋白酶的体外和体内检测方法主要有小分子荧光探针、免疫印迹分析和ELISA等[8～10]，但是免疫印迹方法成本较高， 需要靶蛋白特异性抗体、内参抗体以及二抗，检测费时费力，且一次检测的通量有限。Wigner等[11]利用小分子荧光探针快速检测了尿液中MMP9和MMP13的水平。该方法将MMPs的活性同荧光检测技术巧妙结合，具有高敏感性、快速、方便等特点，适合不同生物样本的分析，特别适合MMPs的高通量检测。目前，尚没有适用于MMP1的小分子探针检测方法。Kleiner等[12]建立了一种基于非还原SDSPAGE电泳和反相凝胶染色的蛋白酶检测方法，即明胶酶谱法，该方法成本低、简单， 适合血浆、组织细胞蛋白提取物或细胞培养上清液等多种生物样本的分析，灵敏度与小分子荧光探针法相当[13]。Roy等[14]将明胶酶谱进一步运用到尿液检测中，并建立了一个基于不同尿液中MMP9活性指纹图谱进行分类的肿瘤分析鉴定方法。 　　重组蛋白表达是小分子荧光探针筛选的基础，获得天然构象的重组蛋白一直是探针筛选过程的重点与难点，利用明胶酶谱法可以对重组蛋白与?仍吹鞍捉?行评估，以改进和加快分子探针的筛选进程。可溶性重组蛋白较包涵体复性蛋白更接近其天然构象，而MMP1蛋白在大肠杆菌中重组表达很容易形成包涵体，需要进行包涵体复性来获得活性蛋白。文献＼[15＼]采用特殊处理方法增加MMP1的可溶性表达，但是并没有分析可溶性MMP1同包涵体复性MMP1的区别以及同?仍?MMP1的关系。本研究尝试不同的表达载体，最终实现通过融合表达硫氧还蛋白（Thioredoxin，TrxA）的方法获得可溶性的MMP1，并利用明胶酶谱法对体外表达的可溶性以及包涵体复性的MMP1进行了对比。研究结果证明， TrxA可以明显提高MMP1的溶解性；同包涵体复性的MMP1相比，可溶性MMP1具有更高的明胶降解活性，更接近体内MMP1的活性。本研究为MMP1的小分子探针筛选提供了更可靠的分子靶点，证明了明胶酶谱法是一种有效的、高灵敏的MMP1检测方法。 　　3.2 重组MMP1的体外表达 　　通过包涵体复性的方法获得活性MMP1的研究已有很多报道，而关于可溶性表达MMP1的报导则很少[14]。本研究在载体pET28a中表达含有His标签的MMP1催化结构域蛋白（MMP1His6）。结果表明，在37 ℃下，1 mmol/L IPTG可以诱导MMP1His6包涵体的形成。并且在4 h内，包涵体蛋白表达量随着时间的延长而增加。同时在pET32a′载体中表达MMP1融合蛋白（TRXMMP1）。同MMP1His6相比较，TRXMMP1在MMP1His6之前含有TrxA蛋白，并且在TrxA和MMP1之间有一个肠激酶酶切位点