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包裹RuBpy二氧化硅荧光纳米探针的制备及其用于肝癌细胞的识别 　　摘 要 制备了两种不同官能团修饰的偶联亲和素的包裹钌联吡啶（RuBpy）二氧化硅荧光纳米探针A和探针B，并分别用于肝癌细胞的识别。通过反相微乳液法制备得到表面修饰不同官能团的纳米颗粒，然后通过亲和素与羧基化包裹RuBpy二氧化硅纳米颗粒相互连接而制备得到探针A；通过亲和素与PEG修饰的荧光二氧化硅纳米颗粒相互作用而制备得到探针B。与探针A不同的是，探针B 通过一个长链PEG分子将亲和素与荧光二氧化硅纳米颗粒偶联在一起。利用免疫荧光成像法将这两种探针分别用于人肝癌细胞的识别，结果表明，含有长链PEG分子的探针B更能够有效地识别肝癌细胞表面肿瘤标志物癌胚抗原（CEA）。 　　关键词 二氧化硅荧光纳米颗粒； 生物偶联； 肝癌细胞； 癌胚抗原 　　1 引 言 　　随着纳米技术的迅猛发展，各种各样的纳米材料已被广泛应用于生物分析、物质分离、疾病诊断和治疗等生物医学领域。荧光纳米材料，如半导体荧光量子点、碳点和包裹染料的二氧化硅纳米颗粒等，通过表面偶联生物功能分子（如抗体或适配体）后，形成具有靶向功能的荧光纳米探针，从而应用于高灵敏的生物分析[1～7]。生物分析最常用的标记材料是有机荧光分子，但具有易光漂白、生物相容性较差等缺点，极大地限制了其应用。为了克服有机荧光染料的上述缺点，开发具有光稳定性的荧光标记材料，成为人们关注的目标。二氧化硅复合荧光纳米颗粒不仅具有良好的生物相容性、表面易修饰、抗光漂白性、低成本、易分离和良好亲水性等优点[8，9]，而且能够使核酸酶远离固定在其表面的DNA分子，从而保护DNA免受核酸酶的降解[10～12]。由于抗体能与抗原特异性结合，目前已有研究将抗体分子偶联到二氧化硅纳米颗粒制备具有靶向性的荧光纳米探针，并将其用于细菌检测、癌细胞识别和抗原检测等方面[13～17]。 　　癌胚抗原（CEA）是一种分子量为180～200 kDa 的多糖蛋白复合物，属于肿瘤细胞表面的结构抗原。CEA 作为一种最常见的肿瘤标志物， 被广泛用作各种消化系肿瘤的诊断及监测指标[18]。免疫标记成像法是一种常见的原位检测肿瘤标志物的方法，它通过研究细胞膜或细胞内部特定生物化学参数的变化与差异来实现对肿瘤细胞的识别与检测，操作简单、结果直观，在癌症的诊断和转移研究领域具有重要意义。 　　本实验以肝癌细胞膜表面CEA为靶标，将包裹钌联吡啶（RuBpy）的二氧化硅复合荧光纳米颗粒表面生物功能化，制备成可进行生物标记的纳米探针，分别用于肝癌细胞LM 9、Huh 7的识别与成像。与染料分子相比，带正电荷的RuBpy分子通过静电作用能够被稳定地束缚在带有负电荷的二氧化硅矩阵里，二氧化硅壳层的保护使自由氧不能接近荧光染料分子。同时，大量的染料分子被包裹在二氧化硅纳米颗粒核内，从而起到信号放大的作用[19～21]。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　二氧化硅纳米颗粒形貌及粒径采用日本JEM100CXII 型透射电镜进行测定；官能团表征采用美国Nicolet 5700 型红外光谱仪测量；细胞成像采用Nikon ECLIPSE TE2000 U 荧光倒置显微镜。 　　曲拉通（Triton X 100）、环己烷、正己醇、氨水、正硅酸四乙酯（TEOS）、羧基乙基硅烷三醇钠盐（CEOS）、＼[羟基 （聚乙二醇） 丙基] 三乙氧基硅烷（HPEOPES）、1 乙基 （3 二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N羟基硫代琥珀酰亚胺（Sulfo NHS）、亲和素（Avidin）、2 （N吗啡啉乙磺酸（MES）、钌联吡啶 （Rubpy），均购于Sigma公司；人肝癌LM 9细胞株由武汉大学中南医院提供；人肝癌Huh 7 细胞株购于中国典型物培养中心；其它试剂均为分析纯，实验用水均采用三次蒸馏水。 　　2.2 表面官能团修饰的二氧化硅荧光纳米颗粒合成 　　包裹染料的二氧化硅纳米颗粒合成采用油包水（W/O）的反相微乳法[22]。首先取1.77 mL Triton X 100、7.5 mL环己烷、1.6 mL 正己醇和400 μL水，于室温下磁力搅拌10 min后形成微乳体系；在此体系中加入80 μL 浓度为 0.1mol/L钌联吡啶溶液，搅拌5 min，加入100 μL TEOS 搅拌30 min后再加入60 μL 氨水在室温下搅拌用于引发形成核壳结构。24 h 后，向体系中加入50 μL TEOS和50 μL CEOS，在室温下进一步搅拌12 h 可以得到羧基修饰的二氧化硅纳米颗粒（RSiNPs COOH）；而PEG修饰的二氧化硅纳米颗粒（RSiNPs PEG）则加入100 μL TEOS和100 μL HPEOPES。当反应完成时，用丙酮破乳，最后分别用乙