沙棘维生素C积累与相关酶活性关系研究.docVIP

沙棘维生素C积累与相关酶活性关系研究 摘要：探讨沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.）不同器官中抗坏血酸（AsA）积累与相关代谢酶活性的关系。结果表明，AsA在沙棘幼叶和果实中含量较高，在茎和花中含量较低。沙棘幼叶和果实中AsA含量主要受L-半乳糖-1，4-内酯脱氢酶（GalLDH）和脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）活性调节，抗坏血酸氧化酶（AAO）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）对AsA的积累也有调节作用。 关键词：沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.）；抗坏血酸（AsA）；L-半乳糖-1， 4-内酯脱氢酶（GalLDH）；抗坏血酸氧化酶（AAO）；抗坏血酸过氧化物酶（APX）；单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）；脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR） 中图分类号：S793.6 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）01-0120-04 DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.01.032 沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.）属胡颓子科沙棘属植物，沙棘果实是中国古代藏医、蒙医的常用药物。中国是沙棘属植物分布面积最大、种类最多的国家[1，2]。沙棘果实中维生素C含量高，素有“维生素C之王”的美称。维生素C又名抗坏血酸（Ascorbic acid，AsA），可以作为辅酶在植物光合作用、细胞分裂和生长代谢中发挥重要作用[3-5]，同时AsA也是植物和大多数动物体内一种重要的抗氧化剂，人类由于缺乏其合成关键酶而不能合成AsA，只能从食物中获取，因此AsA是植物重要的营养指标之一[6，7]。 Wheeler等[7]提出植物体内合成AsA的途径中，L-半乳糖-1，4-内酯脱氢酶（GalLDH）直接催化半乳糖内酯形成AsA，是AsA生物合成途径的关键酶，GalLDH基因表达水平决定了AsA含量的高低。最近的研究结果也表明，过量表达GalLDH可以提高烟草BY-2细胞中AsA含量[8]，反义表达GalLDH mRNA导致GalLDH活性显著下降，以及AsA含量的下降[9]。在植物细胞内，抗坏血酸氧化酶（AAO）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）是AsA代谢过程中主要的氧化分解酶[10]，这2种酶分别在O2和H2O2的参与下将AsA氧化为不稳定的单脱氢抗坏血酸（MDHA），MDHA既可在单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）的作用下还原为AsA，也可发生非酶歧化反应形成脱氢抗坏血酸（DHA），DHA可以通过脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）的作用被还原为AsA，因此植物体内这4种与AsA代谢相关的酶活性也将影响AsA水平的高低[3，6，10，11]。目前有关沙棘维生素C积累的生理机制尚不清楚，为此，本研究通过测定8年生沙棘生长过程中AsA与相关代谢酶活性的关系，以期一定程度上揭示沙棘AsA积累的生理机制。 1 材料与方法 1.1 材料 以青海省祁连县野牛沟乡达玉村种植的8年生沙棘为研究对象，在沙棘发芽、长叶、结果期，采集同一株沙棘上部枝条顶端的叶、茎、果实，去杂质后称重，液氮速冻后置-80 ℃保存备用。沙棘幼叶、幼茎于6月下旬采集，花于7月中旬采集，幼果于8月中旬采集，成熟果实于9月上旬采集。 1.2 方法 1）AsA含量测定。参考Arakawa等[12]和戚元成等[13]的方法并略作改进。取0.3 g样本，加入3 mL 5%的TCA研磨成匀浆，4 000 r/min离心10 min，取上清液备用。测定时，5 mL反应体系中含有1 mL 5%的TCA、1 mL 50%的EtOH、0.5 mL 0.4%的H3PO4- EtOH、1 mL 5%的BP-EtOH、0.5 mL 0. 03%的FeCl3-EtOH和1 mL样品提取液。30 ℃水浴反应90 min，于波长534 nm处测吸光度。 2）GalLDH活性测定。参考Tabata等[8]、安华明等[11]和徐茂军等[14]的方法并略作改进。取0.5 g样本在液氮中研磨成匀浆分装至试管，加入3 mL 50 mmol/L的磷酸缓冲液（pH 7.8，含0.2 mmol/L Na2EDTA，2%的PVP），然后500 r/min离心10 min，收集上清，10 000 r/min离心20 min后收集沉淀。将沉淀轻悬浮于0.5 mL 50 mmol/L的磷酸缓冲液中，供酶活性测定用。以上操作均在4 ℃下进行。 测定时取2 mL 1.05 mg/mL的细胞色素c（Cytc）、200 μL 56 mmol/L的L-半乳糖内酯（L-galactono-1，4-lactone）和200 μL提取液，总体积2.4 mL。测定前先将反应混合液于25 ℃预温热1 min，于波长550 nm处测定吸光度，反应从加入L-