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蟾酥醇提取物的体外抗炎作用研究 摘要：为了考察蟾酥醇提取物的体外抗炎作用，用LPS诱导RAW 264.7细胞和小鼠腹腔巨噬细胞建立细胞炎症模型，采用Griess法测定蟾酥醇提取物对细胞上清液中的NO水平，ELISA法测定TNF-α、IL-lβ、IL-6含量，荧光法测定细胞内ROS水平。结果显示，蟾酥醇提取物对LPS诱导的RAW264.7细胞和小鼠腹腔巨噬细胞所分泌的炎症因子（NO、TNF-α、IL-1β、IL-6）有明显的抑制作用，与空白对照组相比明显降低，同时蟾酥醇提取物极显著降低LPS诱导的细胞内ROS水平（P 0.01）。由此推测，蟾酥醇提取物通过抑制炎症因子、降低细胞内活性氧水平减轻细胞的炎症反应，具有良好的抗炎作用。 关键词：蟾酥醇提取物；RAW 264.7细胞；小鼠腹腔巨噬细胞；体外抗炎；炎症因子 中图分类号：R282.74 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）11-2843-03 DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.11.032 蟾酥别名又称蛤蟆浆、蛤蟆酥、蟾酥眉脂[1]。蟾酥辛温，有毒，具解毒、开窍醒神和止痛之功效。现代药理研究表明，蟾酥具有抗肿瘤、抗放射、改善全身状况、抗炎、恢复细胞免疫功能、提升白血球、缓解癌性疼痛等药理作用[1]。蟾酥具有良好的抗炎作用，但是当前针对蟾酥抗炎的报道多集中在蟾酥制剂的抗炎水平[2，3]，对蟾酥分类、分段提取物的抗炎研究并不多见。在前期研究中，笔者对蟾酥进行了醇处理，获得了主要成分为脂溶性华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的蟾酥醇提取物。因此，本研究的主要目的是以脂多糖（LPS）诱导RAW 264.7细胞和小鼠腹腔巨噬细胞建立炎症细胞模型，初步探讨蟾酥醇提取物的体外抗炎作用，为更进一步的研究奠定基础。 1 材料与方法 1.1 药物与试剂 蟾酥醇提取物的制备：将蟾酥粉碎，取蟾酥粉末按质量体积比加10倍量95%乙醇，浸泡7 d，离心，取上清液，过滤，滤液即为蟾酥醇提取物，经HPLC检测每1 mL含华蟾酥毒基和酯蟾毒配基分别为119.96 μg/μL和85.22 μg/μL。 细胞株：小鼠单核/巨噬细胞株RAW264.7购自中国医学科学院基础医学研究所细胞库。 试剂：RPMI-1640培养基、DMEM培养基、新生牛血清、0.05%胰蛋白酶-EDTA均为Gibco产品；（MTT）、L-谷氨酰胺、LPS均为Sigma公司产品；活性氧试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司；TNF-α、IL-lβ、IL-6细胞因子检测试剂盒均购自于上海劲马生物科技有限公司；PBS购自索莱宝生物科技有限公司；DMSO购自楚杰生物科技有限公司。 1.2 RAW264.7细胞的培养 复苏后的RAW264.7细胞培养于含体积分数为0.1的胎牛血清的DMEM培养基，置37 ℃、5% CO2培养箱培养。传代3次以上，细胞进入对数生长期，即用于试验。 1.3 小鼠腹腔巨噬细胞的制备 给小鼠腹腔注射6%无菌淀粉溶液，48 h后颈椎脱臼处死小鼠，于75%乙醇中浸2～3 min，剪开腹部，暴露腹膜，缓慢注入PBS，吸取腹腔液。重复灌洗2～3次，灌洗液1 000 r/min离心5 min，加入Tris-NH4Cl，于培养箱内孵育10 min，1 000 r/min离心 5 min，用PBS洗1次，用无血清 RPMI-1640培养液洗1次，用 RPMI-1640完全培养液悬浮细胞，200 μm滤网过滤，计数巨噬细胞，台盼蓝染色活细胞 95%，调整细胞浓度为5×106个/mL。 1.4 分组与处理 细胞于37 ℃、5% CO2培养箱培养至次日，弃上清，每孔加入400 μL或200 μL的不同剂量的蟾酥醇提取物（用培养液稀释），在培养箱内孵育1 h后加入10 μL终浓度为10 μg/mL的LPS。试验设蟾酥醇提取物（以华蟾酥毒基成分计）高剂量组（24 mg/L）、中剂量组（12 mg/L）、低剂量组（6 mg/L）、空白对照组、LPS对照组，每组4个重复。 1.5 MTT法检测蟾酥醇提取物对细胞存活率影响的检测 细胞以1×106个/mL的密度接种于96孔细胞培养板过夜，作用48 h后，每孔加入10 μL MTT（浓度为5 mg/mL），在培养箱内孵育4 h，弃上清，每孔加入100 μL DMSO，微振荡10 min后测定OD490 nm。 1.6 Griess法测定细胞上清液中的NO水平 药物作用细胞24 h后收集细胞上清液。于96孔板中每孔加入50 μL细胞上清液，再分别加入 50 μL Griess ReagentⅠ和50 μL Griess ReagentⅡ，微振荡摇匀，避光反应10 min，测定OD450 nm。 1.7 ELISA法检测细胞上清液中的TNF-α、IL-lβ、IL