第三章细胞生物学方法题库.pptVIP

cell biology 分辨率 指能分辨出的相邻两个质点间的最小距离. 分辨率数值越小, 分辨率越高. 人肉眼的分辨率: 0.2mm 光学显微镜的分辨率: 0.2um 电子显微镜的分辨率: 0.2nm 3.制样方法 DIC显微镜以平面偏振光为光源. 光线经棱镜折射后分为两束, 在不同时间经过样品的相邻部位, 再经过另一棱镜将这两束光会合, 样品的厚度差别转化为明暗差别,增加样品反差和立体感. 暗视野显微镜 聚光镜中央有挡光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至 4~200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。 优越性： 1、对活细胞和组织或细胞切片进行连续扫描，可获得 精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的 三维图像。 2、可以得到比普通荧光显微镜更高对比度、高解析度 图象 3、 细胞内离子荧光标记，单标记或多标记，检测细胞 内如PH和钠、钙、镁等离子浓度的比率测定及动态 变化。 4、荧光标记探头标记的活细胞或切片标本的活细胞生 物物质，膜标记、免疫物质、免疫反应、受体或配 体，核酸等观察；可以在同一 样品上进行同时多重 物质标记，同时观察； 5、对细胞检测无损伤、精确、准确、可靠和优良重复 性；数据图像可及时输出或长期储存。 扫描电镜技术 冰冻蚀刻（freeze-etching）亦称冰冻断裂（freeze-fracture）。标本置于-100?C的干冰或-196?C的液氮中，进行冰冻。然后用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为蚀刻（etching）。蚀刻后，向断面以45度角喷涂一层蒸汽铂，再以90度角喷涂一层碳，加强反差和强度。然后用次氯酸钠溶液消化样品，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。复膜显示出了标本蚀刻面的形态，在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构 根据量子力学原理中的隧道效应而设计。当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV~2V），针尖与样品之间产生隧道效应而有电子逸出，形成隧道电流。电流强度和针尖与样品间的距离有函数关系，当探针沿物质表面按给定高度扫描时，因样品表面原子凹凸不平，使探针与物质表面间的距离不断发生改变，从而引起电流不断发生改变。将电流的这种改变图像化即可显示出原子水平的凹凸形态。扫描隧道显微镜的分辨率很高，横向为0.1~0.2nm，纵向可达0.001nm。它的优点是三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察，而普通电镜只能观察制作好的固体标本。 利用扫描隧道显微镜直接观察生物大分子，如DNA、RNA和蛋白质等分子的原子布阵，和某些生物结构，如生物膜、细胞壁等的原子排列 用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为等速度沉降和等密度沉降平衡两种。密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。 等速度沉降（velocity sedimentation）主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。这种方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度. 生物颗粒（细胞或细器）在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。 等密度沉降（isopycnic sedimentation）适用于分离密度不等的颗粒。 细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和足够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。 等密度沉降通常在较高密度的介质中进行 适于分离细胞器，而不太适于分离和纯化细胞。 流式细胞术是对细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。在分析或分选过程中，包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。（flow cytometer）。 动物细胞培养的基本条件 培养基: 营养元素, pH, 离子强度,抗菌素 温度 湿度 环境空气 培养方式 基因的敲除与敲入 基因敲除（gene knock out）: