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人胰岛素MIP融合蛋白在大肠杆菌中表达条件的优化 　　摘 要：MIP即人胰岛素B27赖氨酸去三肽胰岛素 （B27K-DTrI）的前体。B27K-DTrI是一种新型单体速效胰岛素类似物，其单体性质好，生物活性高，是潜在的速效人胰岛素药物。将构建好的重组质粒ppSUMO-MIP转入大肠杆菌BL21（DE3）菌株，利用IPTG进行诱导表达。对MIP融合蛋白的诱导表达时间进行一系列的优化，结果表明：重组质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中最优的表达条件为TB培养基、0.1 mM IPTG，15 ℃诱导过夜。通过表达条件的优化，每升菌液可获得30.1 mg的融合蛋白粗品。为进一步制备单体胰岛素B27K-DTrI打下了基础。 　　关键词：速效胰岛素；SUMO-MIP融合蛋白；表达优化 　　中图分类号：Q78 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20160333046 　　糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病，它现已成为威胁人类健康的最大杀手之一[1]。胰岛素是由胰腺β细胞分泌产生的一类多肽类激素，是体内重要的降低血糖激素[2-3]。胰岛素从问世至今经历了从动物胰岛素、人胰岛素到胰岛素类似物的3大跨越[4-6]。20世纪90年代，人们利用基因工程技术对人胰岛素的氨基酸序列及结构进行局部修饰，合成了人胰岛素类似物，改变了胰岛素的药代动力学特征。速效胰岛素是一类通过基因工程方式获得，与餐后正常人体内胰岛素分泌代谢最为接近的胰岛素类似物[7]。近年来，速效胰岛素以其吸收快、安全性好等特点受到越来越多研究者的关注。 　　MIP即人胰岛素B27赖氨酸去三肽胰岛素（B27K-DTrI）的前体，是2005年由丁金国等人利用甲醇酵母表达系统成功制备的单体速效胰岛素类似物[8]。B27K-DTrI具有单体性质好，生物活性高等特点，是一种新型的速效胰岛素类似物。但是，由于其产量较低限制了B27K-DTrI的产业化。在前期研究中，研究者尝试使用甲醇酵母表达系统和大肠杆菌IMPACT-TWIN系统进行重组制备B27K-DTrI。研究结果表明利用甲醇酵母表达系统进行制备其纯化过程繁琐，得率较低，而大肠杆菌IMPACT-TWIN系统进行制备必须经历复性过程，不仅降低最终产量，而且对蛋白的生理活性也会产生潜在的影响 [9]。因此，试图通过增加MIP前体表达量的方法来提高B27K-DTrI的最终产量。 　　利用大肠杆菌ppSUMO表达系统制备B27K-DTrI。ppSUMO表达系统是大肠杆菌表达系统的一种，通过融合表达SUMO肽可以明显提高重组蛋白的可溶性[10-11]，避免在表达过程中出现包涵体，从而增加蛋白的可溶性表达量。在制备B27K-DTrI前体MIP融合蛋白的过程中，对MIP融合蛋白在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中的表达条件进行优化，改善了表达过程中的诱导温度、诱导剂浓度以及培养基条件，使得MIP融合蛋白产量得到提高（30.1 mg/L），为进一步制备单体胰岛素B27K-DTrI打下了基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　菌株和载体：大肠杆菌BL21（DE3）细胞、ppSUMO-MIP质粒（经测序、鉴定无误）均为本实验室保存。 　　主要试剂：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、卡那霉素、NC膜、Terrific Broth（TB）、Ni-NTASefinoseTM Resin、蛋白质Marker均为生工生物产品，Yeast extra、Tryptone购自Oxoid公司，抗体6*His单克隆抗体购自proteintech。其他试剂均为国产分析纯。 　　主要仪器：摇床、Western转膜、凝胶成像仪（Bio-Rad）等。 　　1.2 方法 　　1.2.1 不同IPTG浓度对融合蛋白表达的影响 　　阳性克隆经测序鉴定正确后，接种到5 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培养基（1 % tryptone， 0.5 % yeast extract， 1 % NaCl， w/v）中，于37℃、225rpm条件下振荡培养过夜，次日按体积比l：100的比例接种到5 mL新鲜的LB培养基中（含50 μg/mL卡那霉素），37℃，225 rpm摇床培养2 h，分别加人终浓度为0.1 mM，0.5 mM， 1 mM的诱导剂IPTG。37 ℃继续培养4 h。诱导前后样品进行12 % SDS鉴定。 　　1.2.2 不同诱导温度对融合蛋白表达的影响 　　细胞与37 ℃摇床培养至OD600=0.5后，加入终浓度为0.1 mM的IPTG，分别在37℃诱导8 h，在15 ℃条件下诱导过夜，离心收集菌体，高压破碎细胞后离心分离上清和沉淀，进行12 %SDS及western鉴定。 　　1.2.3 不同培养基对