土壤中微生物DNA高效提取方法的筛选.docVIP

土壤中微生物DNA高效提取方法的筛选 　　摘要：设计了3种从土壤中直接提取微生物DNA的方法，并通过PCR扩增和DGGE电泳比较了不同方法所提取DNA的质量以及对后期分子生物学研究的适用性。结果表明，化学法和酶法相结合的提取方法所获得的DNA完整性最好，适用于PCR扩增，并且通过DGGE电泳分离出最丰富的条带，是一种高效的提取土壤微生物DNA的方法。 　　关键词：土壤微生物；DNA提取；PCR；DGGE 　　中图分类号：Q939.96；Q523 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）01-0216-04 　　Screening the Extracting Method of Total Microbial DNA from Soil 　　ZHOU Wei1，HUANG Jin-yong2，LI Xin-wei1 　　（1. Luohe Medical College of Higher Education， Luohe 462002， Henan， China； 　　2. Bioengineering Department， Zhengzhou University， Zhenzhou 450001， China） 　　Abstract： Three methods were designed to extract microbial DNA directly from the soil， and the different extraction methods were evaluated comprehensively for the DNA quality and applicability of the molecular biology by PCR and DGGE. The results suggested that the combination of enzymatic and chemical methods could obtain the highest DNA yield and integrity， which was suitable for PCR， and the most abundant bands could be obtained by DGGE. This development of the highly effective DNA extraction method provided a foundation for studying in molecular ecology of soil microbes. 　　Key words： soil microbe； DNA extraction； PCR； DGGE 　　收稿日期：2013-05-10 　　作者简介：周 伟（1981-），男，河南南阳人，讲师，主要从事遗传学方面的研究，（电话电子信箱）luohezhouwei@126.com。 　　微生物在土壤生态系统物质循环和能量转化过程中起重要作用，目前通过纯培养技术只能获得土壤中仅极少数的微生物种类，不能充分体现微生物群落的真实组成[1]。而基于DNA分析的分子生物学技术的引入，降低了对培养技术的依赖性，可以直接对土壤中微生物进行研究[2]。由于土壤中含有大量理化性质复杂的物质，而且微生物与土壤颗粒吸附紧密，不易从中提取DNA；同时土壤中微量的腐殖酸和重金属可能抑制分子生物学操作过程中酶的活性、降低转化效率以及DNA的杂交特异性[3，4]等。因此，从土壤样品中高效地获得高质量的DNA是后期土壤微生物分子生物学研究的前提。 　　土壤中微生物DNA提取的关键在于细胞的裂解，本研究通过对不同的裂解手段进行组合，设计了3种从土壤中直接提取微生物总基因组DNA的方法并对后期扩增效果进行比较分析，以期建立一种高效、简便的土壤微生物DNA提取方法，为分子水平上研究土壤微生物提供参考。 　　1 材料与方法 　　1.1 土壤样品 　　2011年在河南省漯河市孟庙镇进行取样。供试土壤取自常年以冬小麦-春玉米茬口种植的农田，秸秆全部还田，采用五点取样法取土样，取样深度为0～20 cm，混匀后于-20 ℃保存。 　　1.2 试剂与仪器 　　溶菌酶、蛋白酶K购自Sigma公司，所用maker（λ-HindⅢ digested Marke，DNA Marker DL 2000）、凝胶回收试剂盒、PCR Kit购自TaKaRa公司。TGRADIENT温度梯度PCR仪为德国Biometra公司生产，全自动数码凝胶成像与分析系统由天能科技（上海）有限公司生产。 　　1.3 方法 　　对提取土壤微生物DNA方法中不同