双向电泳操作步骤.docVIP

3.1 全菌蛋白的制备 将细菌接种于培养基，置于28培养箱培养18h。参照Coelho 等（Coelho et al. 2004）的方法，略有改动。用Wash buffer（10mmol/L TrisCl pH8.05mmol/L 醋酸镁）清洗细胞3次。离心，细胞沉淀在Lysis Buffer 7mol/L 尿素 2mol/L硫尿1% IPG Buffer pH3-10或 pH4-74% CHAPS，1% DTT， 1%蛋白酶抑制剂，1%核酶抑制剂 中悬浮，使其浓度范围在5~10mg/mL。置于冰上裂解2h。13000r/min离心1h取上清-80℃保存。用2-D clean-up Kit 纯化蛋白，再用2-D Quant Kit测定样本中蛋白浓度。 3. 2 2-D lean-Up Kit的使用方法 蛋白质样本在1.5m微型离心管中处理，所有步骤均在冰上进行。 1）将体积100μL的蛋白质样本（含1~100μg蛋白质）置于1.5mL微型离心管中。加入300μL沉淀剂。振荡或倒置搅匀。冰浴中（4~5）培育15。 2）加入300μL共沉淀剂，简单振荡混合一下12000r/min离心5。 3）将上清液尽量多地倾析或吸出，不要搅散沉淀。保持沉淀不变，在其上面加入一层40μL共沉淀剂，冰上培育5。后离心5，去上清。 4）往沉淀加入25μL蒸馏水或去离子水。将管振荡5~10，这时沉淀应散开，但并未溶解于水中。在管中加入1m洗涤缓冲液（在-20下至少预冷1）和5μL洗涤添加剂，振荡直至沉淀完全散开。-20下培育至少30，每10振荡20~30。 5）将离心管以最大速度（至少12000）离心5。小心地将上清液移走弃去。此时应可见白色沉淀，将沉淀简单风干一下（不要超过5）。 6）用裂解液溶解沉淀，以备第一向IEF电泳。振荡管子至少30，在室温下孵育，振荡或用移液管抽吸使之完全溶解。将离心管以最大速度（至少12000）离心5，去掉所有不溶物质，除去泡沫。上清液可以直接加载到第一向IEF 电泳胶上，也可以移至另一个管中，在-80下保存以备日后分析。 3.3 2-D Quant Kit的使用方法 1）用2mg/m浓度的BSA 标准溶液制备标准曲线（0~50μg）。 2）制备含1~50μL待测样本的微型离心管，一式两份。有效检测范围是0.5~50μg。 3）每个微型离心管中（包括含BSA 标准溶液的离心管）加入500μ沉淀剂。振荡并在室温下培育 2~3。 4）加入500μL辅助沉淀剂，短暂混匀。 5）离心（至少10 000r/min）5。弃去上清液。再次短暂离心将残余的上清液集中至管底，用微量移液管吸去残余的上清液。操作要快，避免离心沉淀再溶或分散开。此时应无可见的液体成分残留。 5）每个管中加入 100μ铜溶液和 400μ蒸馏水或去离子水。振荡使沉淀的蛋白质溶解。应彻底振荡混匀，确保沉淀完全再溶解。 6）每个管中加入 1m工作比色剂，应确保以最快的速度加入，使之与样本立即相混。在室温下培育 15~20。采用分光光度计，如Ultrospec1100 pro UV/ 可见光分光光度计，测定样本和标准液的480nm波长吸光率。 7）根据标准溶液蛋白质含量的吸光率，标绘标准曲线。将样本与标准曲线比较，得到样本蛋白质浓度。 3.4双向电泳 主要是依据GE Healthcare公司双向电泳操作手册进行，并参考GE Healthcare描述方法进行一些改进 Berkelman et al. 1998 。 3.4.1 一向等电聚焦（IEF） 13cm pH 3-10的胶条每胶条上样150μg蛋白。24cm pH 4-7的胶条，每胶条上样300ug蛋白。胶条上样后于20水化l2h。水化好的胶条移至Ettan IPGphor III水平电泳仪按照：S100v 1h，S200v 1h，S500 v 1h，G1000v 1h，G10000v 3h，S10000v 8h至等电聚焦完成。等电聚焦结束后, 迅速取出IPG 胶条, 先置于平衡液A 6 mmol/L Urea2% SDS，75 mmol/L Tris-HCl pH8.8，29.3%甘油，1% DTT，痕量溴酚蓝 平衡15min后，再将胶条置于平衡液B 6mmol/L Urea2% SDS，75mmol /LTris-HCl pH 8.8，29.3%甘油，2.5%碘乙酰胺，痕量溴酚蓝 平衡15 min。 3.4.2 二向SDS将平衡好的胶条转入Ettan DALTsix垂直电泳槽中进行第二向电泳，聚丙烯酰胺凝胶浓度为12%，电泳条件为每胶1W ，电泳1h，然后每胶20W直至溴酚蓝指示线到达凝胶底部停止电泳。 3.4.3 银染 将凝胶在玻璃板上剥离下来后，置于固定液 40%无水乙醇 30min，倒去固定液，换敏