酶的分离纯化分析.ppt

第三章 酶的分离纯化 内容 概述 破碎与提取 沉淀法 层析分离 电泳 其它分离方法 酶的剂型与保存 第一节 概述 一、酶分离纯化的一般原则： 1.切记酶是蛋白质，防止酶变性失活 1 酶纯化一般在低温条件下进行（0～4℃）， 2 各种溶液应该用缓冲液，pH应调到使酶最稳定的pH。 3 各种溶液中还可以加入酶保护剂。 2 建立一个可靠和快速的测活方法 方法专一、灵敏、精确、简便、经济 3. 酶原料的选择 选择目的酶含量丰富的原料，且考虑原料的来源、取材方便、经济等因素。 4. 酶的提取 5. 酶的提纯 产率 目的酶的总活力/粗抽提液中目的酶总活力 *100% 反映提纯过程酶活力的损失情况 提纯倍数 目的酶的比活力/粗抽提液中目的酶比活力 提纯方法的效率 6.酶的纯度检验 当把酶提纯到一恒定的比活时，即可认为酶已纯化，仍需电泳、层析、离心等方法对纯化的酶进行纯度检验。 二、酶纯化过程的三个阶段 粗蛋白 crude protein 采样 破细胞 提取全部蛋白，多用盐析沉淀法。 部分纯化 partially purified 初步的纯化，使用各种柱层析法。 均质纯化 homogeneous 目的酶的进一步精制，可用制备式电泳或HPLC。 第二节 破碎与提取 一、生物材料的破碎 1. 动、植物材料 绞肉机切碎，高速组织捣碎机，加砂研磨 2. 微生物材料 霉菌材料比较容易，可通过机械剪切、研磨或加细胞壁溶解酶解决。 细菌，少量材料常用超声波破碎器和溶菌酶等处理；大量材料通常采用丙酮干粉法，或采用自溶法。 酵母细胞壁厚较难对付，过去多用自溶法，现在可采用的办法有： 1 细胞壁溶解酶处理法； 2 盐振荡法； 3 冷热破壁法。 二、抽提 细胞破碎后，可采用两种方式进行抽提： 普遍抽提和先后用不同溶剂进行选择性抽提。 抽提条件的选择： 一般用稀盐、稀酸或稀碱的水溶液进行抽提。 需要考虑的因素 pH 不应超出酶的稳定范围； 远离待抽提酶的等电点。 兼顾到有利于切断酶和细胞内其它成分间可能的联系，从这点考虑以选用pH4—6为佳。 2. 盐 大多数蛋白质在低浓度的盐溶液中有较大的溶解度，所以抽提液一般采用等渗盐溶液。 最普通的加0.020—0.050M的磷酸缓冲液、0.15MNaCl等。 少数情况用水抽提效果亦佳. 3. 其它 在破细胞后，某些亚细胞结构也往往受到损伤，这样就可能给抽提系统带来各种不稳定因素。为此，有时还需要在抽提液中加入某些物质。 4. 抽提液的用量： 通常采用原料量的l—5倍，有时为了抽提效果好些，要反复抽提，液量可能大些。 5. 固体成份除去： 抽提后的细胞残渣或发酵液的固体成份多可用离心法或压滤法除去。 纯化方法的选择 1.　为了获得理想的分离效果应注意： 工作前应对所要纯化的酶的理化性质 溶解度、分子大小和解离特性 以及酶的稳定性等有一个较全面的了解。 判断选择的方法与条件是否适当，始终应以活力测定为准则。 要严格控制操作条件，防止变性。 2 酶的物理化学性质建立的一般方法： 1）溶解度： 盐析 有机溶剂沉淀法 选择性沉淀法 共沉淀法 PEG沉淀法、 等电点沉淀法 2）分子大小差异：凝胶过滤 超过滤 离心 超离心 3 ?电学、解离特性差异：吸附 离子交换 电泳（区带、等电聚焦） 聚焦层析 疏水层析 高压层析 HPLC 4 ??稳定性差异： 选择性热变性 选择性酸碱变性 选择性表面变性 5）特殊基团差异: 亲和层析 有的方法是建立在上述二个功能同时起作用。 1.盐析法 是古老的、也是目前仍广泛采用的方法。 1 盐析法的原理： 根据酶和杂蛋白在高的盐浓度溶液中溶解度的差别而建立的一种纯化方法。 2 产生盐析作用的原因 等电点与环境 pH 的关系 提高盐浓度增加蛋白质的溶解度盐溶 盐离子与蛋白质表面具相反电性的离子基团结合，形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间电排斥作用减弱而能相互靠拢，聚集起来。 中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去水化膜，暴露疏水区域，由于疏水区域的相互作用，使其沉淀。 3 盐析剂的选择 就阳离子来说，一价盐通常比二价盐有效； 阴离子则相反，二价盐比一价盐好。 符合这种条件的盐有硫酸铵、硫酸钠等。 硫酸铵最常用。 硫酸铵沉淀优点 溶解度大，溶解的温度系数小 0℃，706克／升；25℃，767克／升 ； 稳定性好，高浓度低温对蛋白构象有稳定作用； 低格低廉，可大量使用。 饱和度调整 加入固体盐。不增大溶液体积。 饱和溶液。原溶液体积不大。 透析平衡法 4 影响盐析的因素 1 pH 接近于待纯化酶的等电点。 2 温度 从酶的稳定性和溶解度看，盐析温度一般以控制在30