血红蛋白的分离.ppt

血红蛋白 两个α－肽链 两个β一肽链 四个亚铁血红素基团 每个肽链环绕一个亚铁血红素基团， 此基团可携带一分子氧或一分子二 氧化碳，血红蛋白因含有血红素而 呈红色。 血红蛋白的特点： 一、基础知识 ㈠ 凝胶色谱法（分配色谱法） 1、凝胶： 一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖） 2、概念： 根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法 3、原理： 用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质 A．路程较长，移动速度较慢 B．路程较长，移动速度较快 C．路程较短，移动速度较慢 D．路程较短，移动速度较快 D 相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个 B ㈡缓冲溶液： 能够抵制（ ） 对溶液的（ ）的影响，维持PH 基本不变。 外界的酸或碱 PH值 ⑴.概念： 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 ㈢电泳： ⑵.电泳原理： 电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 ⑶.常见电泳类型： ①琼脂糖凝胶电泳 ②聚丙稀酰胺凝胶电泳 ③SDS——聚丙稀酰胺凝胶电泳 迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小、形状。 电泳迁移率完全取决于分子的大小。 使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于 A 电荷的多少 B 分子的大小 C 肽链的多少 D 分子形状的差异 分离血红蛋白溶液 有机溶剂 （无色透明的甲苯层） 脂类物质 （白色脂溶性物质沉淀层） 血红蛋白溶液 （红色透明液体） 红细胞破碎物沉（暗红色沉淀物） 下列操作正确的是（ ） A. 分离红细胞时采用低速长时间离心 B. 红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可 C. 分离血红蛋白溶液是低速短时间离心 D. 透析时要用20mmol/l的磷酸缓冲液，透析12h D 在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理过程中，分析无误的是 A洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐 B洗涤时离心速度过小，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果 C洗涤过程选用0.1%的生理盐水 D透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质 D 2.凝胶色谱操作: ⑴.凝胶色谱柱的制作： 注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。 ⑵.凝胶色谱柱的装填 ①凝胶的选择： ②凝胶的前处理： ③凝胶色谱柱的装填方法： 注意：1.凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2.装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 ④洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。 注意：1.液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。 2.不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。 50cm高 装配好的凝胶柱 ⑶.样品加入与洗脱 ①调节缓冲液面 ②滴加透析样品 注意：正确的加样操作是： 1.不要触及并破坏凝胶面。 2.贴壁加样。 3.使吸管管口沿管壁环绕移动。 ③样品渗入凝胶床 ④洗脱 ⑤收集 注意：在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功。 开始进行层析 收集得到的纯化后的蛋白 二、实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步： （1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白释放；离心等操作收集到的血红蛋白溶液。 （2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。 （3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。 （4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。 实践训练 1.下列各项中，一般不影响在凝胶色谱法分离蛋白质中的分离度的是 A.层析柱高 B.层析柱的直径 C.缓冲溶液 D.样品的分布 2.蛋白质的提取和分离一般分为四步，即＿＿＿＿、＿＿＿＿、＿＿＿和＿＿＿＿＿。后三步常用的方法依次是＿＿＿＿、＿＿＿＿＿＿、＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。 B 粗分离 纯化 样品处理 纯度鉴定 透析法 凝胶色谱法 SDS—聚丙烯酰胺 凝胶电泳 3.下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是（ ） A．可采集猪血作为实验材料 B．用蒸馏水重复洗涤红细胞 C．血红蛋白释放后应低速短时间离心 D．洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液 A