血清清蛋白_γ-球蛋白的分离纯化与定量----薛彪。。。裴婕.doc

血清清蛋白、γ-球蛋白的分离与纯化与定量 实验设计 南方医科大学 公共卫生与热带医学学院学院 10级预防医学（食品安全） 学号：3100091046姓名：薛彪 学号：3100091047姓名：裴婕 日期：2011年10月19日 摘 要 健康人或动物血清中含有丰富的血清清蛋白，α1-球蛋白，α2-球蛋白，β-球蛋白，γ-球蛋白等。血清白蛋白是血清中含量最丰富的蛋白质，占血清总蛋白量的50%以上，血清蛋白是血液中脂肪酸的携带者。当身体需要能量或者需要建造材料时，脂肪细胞就把脂肪酸释放到血液中 ，脂肪酸被血清蛋白获取，并被运送到需要的部位。血清蛋白是血浆里最丰富的蛋白质。每一个蛋白分子能携带七个脂肪酸分子。这 ?? 血清蛋白模型 些脂肪酸分子结合在蛋白的缝隙中，它们富含碳的尾部埋藏在里面安全地避开周围的水分子。血清蛋白同样能够携带许多其它的不溶于水的分子。尤其是血清蛋白，能够携带着许多药物分子，比如布洛芬。 正因为血清蛋白是如此普遍地存在于血液中并且如此容易地被提纯，所以它成为科学家最早研究的蛋白质之一。今天，当需要一种蛋白质时，一种来源于牛体内的类似的蛋白在研究中被广泛地使用，这种蛋白叫做牛族血清蛋白或者称作BSA。许多酶在稀溶液中不稳定，解决的办法是加入一些牛族血清蛋白。在试验中它能使酶稳定，且相对地中性,不会影响酶NH4AC溶液 4.1.5 饱和的硫酸铵溶液 4.1.6 0.92mol/l磺基水杨酸 4.1.7 0.05mol/lBaCl溶液 4.1.8 双缩脲试剂 4.1.9 蛋白质标准 4.1.10 健康人的血清或动物血清 4.2 仪器及器材： 1.层析住2.烧杯3.吸管4.滴灌5.试管6.黑色反应板7.贴固定架8.螺旋夹9.离心管和离心机10.分光光度计 和水浴箱 4.3 试剂的配制： 4.3.1 0.3mol/l的PH6.5醋酸铵缓冲液：称取醋酸按23.12g，加蒸馏水800ml溶解，滴入稀氨水或稀醋酸液（注意混合均匀），调节PH至6.5后，加蒸馏水至1000ml。 4.3.2 0.06mol/l的PH6.5醋酸铵缓冲液：取上液用蒸馏水做5倍稀释。 4.3.3 0.02mol/l的PH6.5醋酸铵缓冲液：取上液用蒸馏水做3倍稀释。 注意：上述三种溶液的PH必须准确，用蒸馏水稀释后营再测PH。由于醋酸铵可遇热分解，故配置溶液时不得加热，配好后必须密封保存，以防PH和浓度发生改变，否则将影响分离蛋白质的纯度。 4.3.4 1.5mol/l的NaCl-0.3mol/NH4AC溶液：称取NaCl87.7g溶于0.3mol/LPH6.5的醋酸铵溶液中至1000ml。 4.3.5饱和的硫酸铵溶液：称取固体硫酸铵850g加入1000ml蒸馏水中，在70~80摄氏度下搅拌溶解，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵溶液。 4.3.6 0.92mol/l磺基水杨酸 4.3.7 0.05mol/lBaCl溶液 4.3.8 双缩脲试剂：精确称取硫酸铜3.0g、酒石酸钾钠9.0g及碘化钾5.0g，各自分别溶于25ml蒸馏水中。将酒石酸钾钠和碘化钾溶液倒入1000ml容量瓶中，加入6.0mol/L氢氧化钠100ml，混匀。再加入硫酸铜溶液，边加边摇，最后加水定容至1000ml，储存于塑料瓶内。此试剂可长期保存，有储存瓶内有黑色沉淀出现，则需重新配置。 4.3.9蛋白质标准：用微量凯氏定氮法准确测出牛血清清蛋白或酷蛋白的蛋白含量，然后用15%氯化钠-麝香草酚溶液稀释成梅1ml蛋白质含量为6.0mg，此蛋白质标准液4摄氏度可保存八个月。 4.3.10 0.9%氯化钠溶液。 5.实验步骤 5.1葡萄糖电泳层析柱的准备 （1萄糖层析柱的准备步骤） 步骤 操作 （1）凝胶的准备 称取干燥葡萄糖凝胶G-25，按每克干胶假加入蒸馏水约50ml。置于沸水浴中1h，取出冷却，待凝胶下沉后，倾去含有细微悬浮物的上层液， 然后重复处理两次，加入两倍量的0.02mol/l,PH6.5 NH4AC缓冲溶液，轻轻搅拌，静止片刻待凝胶颗粒沉降后，倾去上层液 （2）装柱 选用内径1.0cm，高10cm，顶部嵌装有砂芯滤片的层析柱，夹持在支架上，并保持垂直。首先向柱内加入少量的缓冲溶液，将上述处理的过的凝胶粒悬液连续注入层析柱内，直至所需凝胶床高度（约为7cm）C.若凝胶床内出现界面、气泡或流速明显减慢时，将胶粒倒出，重新装柱。D.久用后，如凝胶床表面有沉淀等杂质滞留，可将表面一层胶粒析出，再填补新的凝胶。e.凝胶禁止保存于0摄氏度以下冰箱中，防止冻损胶粒。