绞股蓝皂甙对人衰老皮肤成纤维细胞增殖调控的影响.docVIP

绞股蓝皂甙对人衰老皮肤成纤维细胞增殖调控的影响 　　摘要：目的 研究绞股蓝皂甙对人衰老皮肤成纤维细胞增殖的影响及机制。方法 原代培养并建立人衰老皮肤成纤维细胞系，0、5、10、15 μg/mL绞股蓝皂甙处理细胞，24、72、96 h后MTT检测细胞增殖；72h后流式细胞仪检测细胞周期。结果 10、15 μg/mL绞股蓝皂甙可以促进人衰老成纤维细胞增殖，使S期细胞数增多且呈浓度依赖。结论 绞股蓝皂甙可以使S期细胞数增多且成纤维细胞增殖能力增强，具有延缓细胞衰老的作用。 　　关键词：绞股蓝皂甙；成纤维细胞；增殖；衰老；皮肤 　　衰老是发生在分子、细胞和整个机体水平的一个复杂的进行性的不可逆的过程。体外细胞模型不仅可以重现生物衰老过程，而且可以避免整体研究的诸多不便和干扰因素[1]。成纤维细胞是皮肤真皮中最主要的细胞成分，其结构和功能的异常对皮肤衰老的发生发展有重要影响。绞股蓝是葫芦科草质藤本植物，是五加科之外唯一含有与人参皂甙相似结构皂甙的植物，其皂甙成分具有保护心脑血管、抗脑缺氧、抗肿瘤及抗衰老等药理作用，并在治疗高血脂症、血管性痴呆、消化道溃疡以及中风等方面取得了一定的疗效，因此引起国内外众多学者的重视[2]。本文观察不同浓度绞股蓝皂甙（Gyp）对衰老皮肤的成纤维细胞增殖的调控作用，为绞股蓝在抗衰老方面的进一步研究及应用提供实验依据。 　　1资料与方法 　　1.1实验材料及主要试剂 皮肤标本3例，取自施行眼袋切除术和倒睫矫正术的老年女性眼睑周围的正常皮肤，年龄55～60岁，由中国医科大学第四附属医院眼科提供。绞股蓝皂甙，成都曼思特生物科技有限公司；DMEM培养基、胎牛血清，美国GIBCO公司；胰蛋白酶，美国Sigma公司；磷酸盐缓冲液（PBS），中国北京中杉金桥生物技术有限公司；其他试剂为国产分析纯。流式细胞仪，美国BD公司。 　　1.2方法 　　1.2.1建立细胞系及分组 皮肤标本用胶原酶消化，置37℃，5%CO2培养箱中植块法原代培养，建立衰老的人皮肤成纤维细胞系。实验选用第3～6代细胞，分为两组：空白组（A组）和给药组（B、C、D组）。0、5、10、15 μg/mL绞股蓝皂甙处理细胞，24、72、96 h后，MTT检测细胞增殖情况；72 h后流式细胞仪检测细胞周期。 　　1.2.2制备绞股蓝皂甙 取0.1 g绞股蓝皂甙溶于1 mL二甲基亚砜（DMSO），配成100 mg/mL的贮存液，DMEM培养液倍比稀释，使其终浓度分别为5、10、15 μg/mL。 　　1.2.3 MTT法检测细胞增殖 制备单细胞悬液，接种于96孔板上。分别加入绞股蓝皂甙0、 5、10、15 μg/mL，同时根据DMSO的浓度做相应溶剂对照，每例细胞的每一药物浓度孔及相应溶剂对照孔均做5复孔。另做1孔不加细胞，只加培养液和绞股蓝皂甙。共做3块培养板。培养24、72、96 h时各取出1块培养板，MTT法检测各孔吸光度值[3]。 　　1.3流式细胞仪检测细胞周期[4] 胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，PBS洗涤，弃上清，75%乙醇固定，4℃过夜，800 rpm离心5 min，弃上清，冰PBS 洗涤，弃上清，1 mL 冰PBS液重悬细胞，400目尼龙网过滤，加入10 mg/mL的RNase A 2 μL，37℃孵育45 min；加入1 mg/mL的PI染10 μL，4℃避光染色1h，流式细胞仪检测分析，重复3次。 　　1.4统计学方法 数据以（x±s）表示，采用SPSS13.0软件进行统计分析。方差齐时，行单因素方差分析，LSD方法进行多组间两两比较；方差不齐时，采用非参数分析进行多组间比较，Dunnett T3方法进行多组间两两比较[5]。 　　2结果 　　2.1浓度和时间对衰老成纤维细胞增殖的影响 加入不同浓度绞股蓝皂甙，培养24 h、72 h、96 h可见，各组细胞均继续生长，24～72 h，细胞生长较快，72～96 h细胞生长放缓。培养24 h、72 h，与A组比较，B组无促进细胞增殖作用，C组、D组表现为增殖促进（P0.05），且D组的增殖促进作用更强（P0.05）。培养96 h，呈饱和状态，药物浓度对细胞增殖作用无明显差异，见图1。 　　2.2浓度对衰老成纤维细胞细胞周期的影响 与A组比较，B组无统计学意义（P0.05）；C组、D组DNA合成期（S期）的细胞数均增高（P0.05，P0.01），且D组增高更显著（P0.05）。提示较高浓度的绞股蓝皂甙使处于S期的细胞数增加，见表1。 　　3讨论 　　皮肤衰老是内源性和外源性因素（如紫外线、烟尘等）共同作用的结果，因此可以作为研究各种因素对衰老综合作用的模型[6]。皮肤由表皮和真皮构成，真皮的结构和功能的改变是皮肤衰老多种临床表现的基础，成纤维细胞在其中的作用已被越来越多