登革热样本采集、保存和运输综述.ppt

样本采集、保存和运输 标本采集 用无菌真空干燥管，采集患者非抗凝血，及时分离血清，分装2份，保存于带螺旋盖、内有垫圈的冻存管内，标记清楚后低温保存，其中1份用于现场实验室检测，1份用于上级预防控制机构复核。 登革热临床诊断病例及疑似病例，每次采集血液标本5mL。 登革热临床诊断和疑似的住院病例（包括初筛阴性），应采集双份血液标本，入院当天和出院前1天各一份。 疫点首发病例，必要时应采集第二份血标本，距第一份血样采集日期间隔在7天以上。 样本采集、保存和运输 运送保存 如果24小时能够完成初筛检测，并将标本运送至上级单位，运送前应将标本保存于2-8℃冰箱，运送时采用低温冷藏运输。 如果不能及时运送，运送前应将标本保存于-20℃冰箱，运送时采用干冰或低温冷藏运输。 样本长期保存应记录剩余血清量和盒中位置，保存于-70℃以下冰箱。 所有样本运输和保存应遵守国家相关生物安全规定。 谢 谢 登革热实验室检测 云南省寄生虫病防治所 2014年10月 概要 检测目的 检测对象 检测内容 实验室检测 复核检测 检测方法 样本采集、保存和运输 检测目的 及时发现、诊断病例。 病毒分型和溯源。 为登革热流行趋势的预测、预警和制定防治对策、措施提供科学依据。 检测对象 疑似和临床诊断病例（按照登革热诊断标准WS216-2008）。 检测内容 实验室检测 登革热疑似病例发生所在地医院和/或县（市）疾控机构采集病例血清，检测登革病毒抗原、核酸或抗体。 登革热疑似病例实验室检测流程 检测内容 复核检测 送州/市CDC或云南省寄生虫病防治所的临床标本，抽样30%进行复核检测，疫点首发病例需采用病原学和/或双份标本血清学方法复核检测，暴发疫情复核检测不少于5例，疫情少于5例者应全部检测，病毒核酸阳性标本应分型检测。 疫点首发病例，重症病例、输入病例急性期标本应采用PCR方法进行分型检测，阳性者分离病毒，从临床标本或所分离病毒中扩增E蛋白编码基因，完成序列分析。 实验室检测阴性临床病例以及重症病例，应对恢复期血清进行IgM、IgG抗体和/或中和抗体检测。 检测方法 病原学检测 主要适用于急性期血液标本。 1、抗原检测：一般发病后5天内血液标本NS1抗原检出率高。标本中检出NS1抗原可以确诊病毒感染，适用于现场快速检测，可用于早期诊断 2、核酸检测：一般发病后6天内血液标本病毒核酸检出率高。在病人血清中检出病毒核酸，可确诊而且能够分型，可用于早期诊断，但核酸检测容易因污染而产生假阳性，因此要求严格分区操作 3、病毒分离：一般发病后5天内血液标本病毒分离率较高。将标本接种于蚊源细胞（C6/36）或哺乳动物细胞（BHK21、Vero）进行分离培养，出现病变以后，用检测抗原或核酸的方法鉴定病毒。分离到登革病毒可以确诊，但其耗时长，不适于快速诊断。 检测方法 血清学检测 主要适用于发病5天以后血液样本，但需注意可能与其他黄病毒感染发生交叉反应。 1、血清特异性IgM抗体：采用ELISA、免疫层析等方法检测。IgM抗体阳性，提示患者可能新近感染登革病毒，适用于登革热早期诊断，但单份标本不能确诊 2、血清特异性IgG抗体：采用ELISA、免疫荧光（IFA）、免疫层析等方法检测。患者恢复期血清 IgG 抗体阳转或滴度较急性期呈4倍及以上升高可以确诊 3、中和抗体：采用空斑减少中和实验、微量中和实验等方法检测，可用于分型。患者恢复期血清中和抗体阳转或滴度较急性期呈4倍及以上升高可以确诊。 酶联免疫法检测登革病毒NS1抗原 检测仪器设备和材料 加样器、温箱、洗板机、含波长450nm的酶标仪、登革病毒抗原检测试剂盒（酶联免疫法） 酶联免疫法检测登革病毒NS1抗原 操作步骤 1 、将试剂盒在冰箱中取出，放置室温平衡30分钟，使用前将试剂轻轻震荡混匀。 2 、配液：将试剂盒中浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释。 3 、编号：将样品对应微孔板编号，每板设阴性对照3孔，阳性对照2孔和空白对照1孔。 4 、加稀释液：每孔加稀释液50μL，空白孔除外。 5 、加样：分别在相应孔加入待测样品或阴阳性对照各50μL，空白孔除外。 6、 温育：用封板膜封板后，置37℃温育60分钟。 7 、每孔加酶标试剂50μL，空白孔除外，轻轻震荡混匀。 8、 温育：用封板膜封板后，置37℃温育30分钟。 9 、洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。 10、显色：每孔加入显色剂A、B液各50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。 11、测定：每孔加终止液50μL，10分钟内测定结果。设定酶标仪波长于450nm处（建议使用双波长450nm/600-650nm检测），用空白孔调零后测定各孔A值。 酶联免疫法检测登革病毒NS1抗原 结果判定 1、 临界值计算：临界值=0.10+阴性对照