55毕业论文第五章＋蛋白质芯片doc.docVIP

第五章 蛋白质芯片的构建及性能研究 生物科学正迅速地演变为一门信息科学，基因芯片作为成功的例子，已广泛应用于生物基础研究及临床医学各领域[1]，例如，Schena[2]等用拟南介基因组内共45个基因的cDNA微阵列，检测该植物的根、叶组织内这些基因的表达水平；Gress[3]等利用基因芯片技术提出了参与胰腺癌恶性表型形成的特异基因表达谱和可能的致病基因或疾病相关基因；Lee[4]等用含有135000个探针的DNA微阵列分析了人线粒体基因组DNA多态性变化；Hacia[5]等用含有48000个寡核苷酸的高密度微阵列分析了黑猩猩和人BRCAⅠ基因序列差异，高度提示了二者在进化上的相似性，基因芯片正不断取得新的进展。然而基因芯片只能检测到人体各种遗传信息在DNA/RNA水平的变化，而无法检测出在蛋白质水平上的变化。同时基因芯片的制作和检测费时，所需探针必须人工合成，必须经PCR扩增过程，还要进行昂贵的荧光标记。随着人类基因组计划测序工作的完成，下一步将要进入更加复杂的蛋白质功能的研究，迫切需要蛋白质芯片技术。 §5.1 蛋白质芯片概述 蛋白质是生命体中最丰富和最重要的大分子之一。从高等动植物到低等微生物乃至病毒，都是以蛋白质为主要组成成份的。例如，蛋白质在人体中占干重的45%，在酵母中占干重的46.6%，在细菌中占50~80%，而在病毒中除了一小部分是核酸外其余都是蛋白质。 蛋白质不仅是生物体的主要组成成分，更为重要的是蛋白质在生命活动中起着极为重要的作用。蛋白质是由许多氨基酸按一定的排列顺序通过肽键相连而成的多肽链。在DNA上的遗传信息绝大部分编码的是蛋白质的氨基酸排列顺序，它们最终需要表达成蛋白质才能起作用。在一个小小的细胞中，蛋白质的种类数以千计，担负着生命活动这一复杂过程的每一环节。仅在大肠杆菌种就可以通过同位素标记后用双向电泳检测到三千多种不同的蛋白质。蛋白质是生物表现千差万别的功能的基本物质。 基因组序列的信息是由蛋白表达才行使其功能的，进而使生命能够正常进行。真正研究基因表达谱必然要在两个层次上进行，mRNA 和功能性蛋白质，分别对应于中心法则的两个阶段。DNA芯片是在mRNA层次研究，mRNA的转录情形却与基因的终末产物蛋白质的翻译情形不见得一致，更不要说复杂的翻译后修饰（糖基化，磷酸化及乙酰化等关系细胞生命活动中快速响应的过程）了，而事实上从最终决定组织细胞生理病理状态的蛋白组却缺乏相应的快速、并行、高度特异的方法，而且一直没有诞生象PCR大量扩增核酸一样等价的多肽扩增技术。应用大规模排阵和分子杂交的思想成功地制造出DNA芯片，应用类似的思想也可以制造蛋白质芯片（protein chip），联合DNA芯片可以完整地检测特定组织细胞基因的表达情况。 蛋白质芯片与基因芯片的基本原理类似，但它利用的不是碱基配对而是抗体与抗原结合的特异性即免疫反应来检测。蛋白质芯片构建的简化模型为：选择一种固相载体能够牢固地结合蛋白质分子（抗原或抗体），这样形成蛋白质的微阵列，即蛋白质芯片。如果加入与之特异性反应的带有特殊标记的蛋白质分子（抗体或抗原），两者结合后，通过对标记物的检测来实现抗原抗体的互检，即蛋白质的检测。此种方法构建的模型所需蛋白质的量极少，反应相对较快，蛋白质芯片稳定性较好，灵敏度较高，在临床检测方面大有发展。 蛋白质芯片以蛋白质代替DNA作为检测目的物，比基因芯片更进一步的接近生命活动的物质层面，因而有着比基因芯片更加直接的应用前景。 §5.2 蛋白质芯片构建的技术平台研究 2000年7月中旬，在人类基因组测序方面大出风头的美国塞莱拉基因公司宣布，他们在完成了人类基因组工作草图之后，已经开始了围绕人体蛋白质进行的研究，以全面破解主导人体内所有化学反应的蛋白质，了解人体所有蛋白质之间的功能及其相互间的关系、以及它们引发疾病的原理。这种研究被称为蛋白质组学，目前已有不少科学家在进行这方面的工作，但以商业为目的的研究，这还是第一次。这也意味着随着人类基因组大规模测序工作接近尾声，以功能基因组学和蛋白质组学为主要研究内容的后基因组时代来临。蛋白质芯片作为检测蛋白质存在和运动变化的高效工具，必将发挥越来越大的作用。 Angelika Lueking和Martin Horn等研究和发展了一个在cDNA微矩阵上进行基因表达谱研究的一种辅助的方法[6]，这种技术能够在芯片大小的蛋白微矩阵上进行大量的基因表达和抗体筛选。这种技术应用一种带有一种新的转移图章的机械手进行点样，蛋白溶液被高密度的点在聚偏二乙烯二氟（PVDF）膜上。在此膜上能够高灵敏度的检测出经纯化的特殊蛋白。在该试验中，用92个人cDNA克隆在酶标板上表达所得细菌溶胞物作为蛋白质点成芯片，在此芯片上能够可靠地进行纯化的蛋白表达物的检测。假阳性克隆